CRISPR) është një teknikë e redaktimit të gjenomit të gjeneratës së tretë: CRISPR revolucionarizoi botën

Përsëritjet e shkurtra palindromike të grupuara rregullisht (CRISPR) janë një teknikë e redaktimit të gjenomit të gjeneratës së tretë që ka revolucionarizuar botën me rezultatet e saj me rendiment të lartë. Është përdorur për të trajtuar sëmundje dhe infeksione të ndryshme biologjike. Baktere të ndryshme dhe prokariotë të tjerë (si arkeat) gjithashtu kanë sisteme CRISPR/Cas9 për t'u mbrojtur kundër fagëve. Është raportuar se strategjitë e bazuara në CRISPR/Cas9 mund të pengojnë rritjen dhe përparimin e kancerit të gjirit trefish negativ (TNBC) duke synuar gjenet e rezistencës potencialisht të ndryshuara, transkriptimin dhe rregullimin epigjenetik. Këto ndërhyrje terapeutike mund të ndihmojnë në adresimin e problemeve sfiduese siç është rezistenca ndaj ilaçeve e vërejtur edhe në TNBC. Aktualisht, përdoren metoda të ndryshme për të ofruar CRISPR/Cas9 në qelizat e synuara, të tilla si fizike (mikroinjeksion, elektroporacion dhe mënyra hidrodinamike), virale (virus i shoqëruar me adeno dhe lentivirus) dhe jo-virale (lipozome dhe nanopjesëza lipidike). Edhe pse janë zhvilluar modele të ndryshme për të studiuar shkaqet molekulare të TNBC-së, mungesa e metodave të ndjeshme dhe të synuara për ofrimin e mjeteve të redaktimit të gjenomit in vivo kufizon zbatimin e tyre klinik. Si përmbledhje, ky rishikim shqyrton në mënyrë gjithëpërfshirëse progresin, sfidat, kufizimet dhe perspektivat e trajtimit CRISPR/Cas9 për TNBC-në bazuar në provat ekzistuese. Ne gjithashtu theksojmë se si kombinimi i inteligjencës artificiale dhe të mësuarit automatik mund të përmirësojë strategjitë CRISPR/Cas9 në trajtimin e TNBC-së.
Kanceri karakterizohet nga ndarja e pakontrolluar e qelizave, ndërprerja e pikave të kontrollit të ciklit qelizor dhe mutacionet në gjenet shtypëse të tumorit (TSG) (Matthews et al., 2022). Ndër llojet e ndryshme të kancerit, kanceri i gjirit është lloji më i zakonshëm i kancerit tek gratë dhe ka një shkallë të lartë vdekshmërie në mbarë botën (Waks dhe Winer, 2019). Kanceri i gjirit është një sëmundje heterogjene me karakteristika të ndryshme, të tilla si tiparet histologjike dhe biologjike, paraqitja klinike dhe sjellja, dhe përgjigja ndaj trajtimit (Weigelt et al., 2010). Klasifikimi i kancerit të gjirit ofron njohuri të sakta për diagnozën e kancerit të gjirit dhe prognozën e tumorit. Përdorimi i biomarkuesve të zakonshëm dhe tipareve klinikopatologjike ka qenë kriteri kryesor për klasifikimin e kancerit të gjirit (Tsang dhe Tse, 2019). Prognoza dhe përgjigja ndaj trajtimit të kancerit të gjirit ndikohet nga faktorë të shumtë, duke përfshirë praninë e receptorit të estrogjenit (ER), receptorit të progesteronit (PR), receptorit 2 të faktorit të rritjes epidermale njerëzore (HER2/neu) dhe gradën histologjike, llojin e tumorit dhe gradën. madhësia dhe metastaza në nyjet limfatike (Al-Tubaiti, 2020). Janë identifikuar pesë nëntipe molekulare intrinsike të kancerit të gjirit, duke përfshirë luminal A, luminal B, HER2-të pasuruar, bazal-like dhe klaudin-low (Prat et al., 2015). TNBC është një nëntip molekular i kancerit që nuk shpreh të gjitha ER, PR dhe HER2 (Yin et al., 2020). Këto karakteristika patologjike shoqërohen me TNBC, duke konfirmuar përparimin e tij të shpejtë dhe natyrën më agresive se çdo lloj tjetër i kancerit të gjirit (Feng et al., 2018). Përveç kësaj, Peru et al. (2000) përdorën teknologjinë e mikroarray për të riklasifikuar kancerin e gjirit dhe për të identifikuar pesë nëntipe intrinsike të kancerit të gjirit (Cadenas, 2012). Kanceri i gjirit bazal-like është një nëntip i kancerit të gjirit që ka një fenotip trefish negativ dhe shoqërohet me përparim të shpejtë. Duhet theksuar se të gjitha kanceret bazale të gjirit zakonisht diagnostikohen gabim si TNBC, por vetëm 77% janë TNBC; Në të kundërt, 71–91% e TNBC-ve janë bazale, duke treguar se këto dy lloje të kancerit të gjirit mbivendosen dhe përfaqësojnë klasifikime të ndryshme (Wang D.-Y. et al., 2019). Kjo krijon nevojën për të karakterizuar heterogjenitetin e TNBC-së për të sqaruar prognozën dhe për të identifikuar përgjigjet e mundshme ndaj trajtimeve aktuale dhe të ardhshme. Përveç kësaj, TNBC përbën 15–20% të të gjitha rasteve të kancerit të gjirit dhe është më i zakonshëm tek gratë nën 50 vjeç. Mutacionet BRCA1 ose BRCA2 janë raportuar në afërsisht 20% të rasteve të TNBC-së (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Studimet kanë treguar gjithashtu se TNBC ka një mikroambient imunitar të dallueshëm që përfshin nivele të larta të faktorëve të rritjes endoteliale vaskulare, makrofagëve të shoqëruar me tumorin (TAM), limfociteve infiltruese të tumorit (TIL) dhe molekula të tjera të përfshira në rritjen dhe migrimin e tumorit. Prandaj, të kuptuarit e mikroambientit të TNBC është kritik për prognozën dhe trajtimin e tij (Fan dhe He, 2022).
Për të vlerësuar prognozën e TNBC dhe për të siguruar trajtim efektiv, është e rëndësishme diagnoza e saktë, kryesisht e bazuar në imunohistokimi (IHC) për të zbuluar ER, PR dhe HER2, dhe mamografia për të zbuluar neoplazmat e gjirit. Megjithatë, mamografia nuk mund të përshkruajë në mënyrë adekuate tiparet intratumorale si nekroza dhe fibroza (Deepak Singh et al., 2021). Meqenëse prognoza dhe diagnoza e dobët i pengojnë mjekët të përshkruajnë ilaçet e duhura (Chaudhary, 2020), përdoren strategji të ndryshme për të përmirësuar kujdesin për pacientët me TNBC. Aktualisht, dy ilaçe, doksorubicina dhe ciklofosfamidi, përdoren tek pacientët me TNBC dhe kanë treguar rezultate të mira. Përveç kësaj, përdoren edhe ilaçe të tjera platini, të tilla si karboplatina dhe cisplatina (Sikov et al., 2015). Përveç kësaj, frenuesit e PARP si Olaparib, Velaparib dhe PF-01367338 janë përdorur si ilaçe të mundshme kimioterapie për trajtimin e TNBC (Ishino et al., 2018). Meqenëse rrugët e sinjalizimit Wnt/b-Catenin, NOTCH dhe Hedgehog janë raportuar të jenë të përfshira në shfaqjen dhe përparimin e TNBC-së, shënjestrimi i barnave në këto rrugë mund të jetë një strategji e rëndësishme (Aysola et al., 2013). Edhe pse kirurgjia, radioterapia dhe kimioterapia mbeten shtylla kryesore e trajtimit për TNBC-në sot, është bërë përparim i konsiderueshëm në zhvillimin e trajtimeve të reja duke përfshirë terapinë e synuar, imunoterapinë, mjete të ndryshme të redaktimit të gjeneve të lidhura me CRISPR si Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, redaktimi prime dhe terapia gjenike e synuar nga CRISPR/Cas9. Këtu do të përqendrohemi në mjete të ndryshme të redaktimit të gjeneve të lidhura me CRISPR të përdorura në trajtimin e TNBC-së. Midis tyre, CRISPR/Cas9 ka marrë vëmendje të gjerë.
Cas9n, i njohur edhe si nikaza Cas9, është një variant i modifikuar gjenetikisht i proteinës Cas9 që rrjedh nga sistemi i redaktimit të gjenomit CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Në formën e saj origjinale, proteina Cas9 përmban dy domene nukleazash: RuvC dhe HNH, funksioni kryesor i të cilave është copëtimi i të dy fijeve të ADN-së. Megjithatë, në Cas9n, një nga domenet e nukleazave, HNH, është mutuar gjenetikisht dhe bëhet joaktive. Prandaj, domeni HNH i Cas9n mbetet jofunksional. Vetëm domeni RuvC mbetet aktiv, duke i lejuar Cas9n të presë ose të krijojë çarje në fijet e vetme të ADN-së (Trevino dhe Zhang, 2014). Krahasuar me Cas9, Cas9n mund të zvogëlojë në mënyrë efektive efektet jashtë objektivit dhe të përmirësojë me saktësi mekanizmat e riparimit të qelizave. Cas9n mund të përdoret për të zgjidhur probleme të ndryshme, të tilla si krijimi i çarjeve në vende specifike në ADN-në me dy fije. Për këtë qëllim, dy molekula Cas9n u kombinuan dhe u përdorën së bashku (Yee, 2016). Kinaza 3 e linjës së përzier (MLK3) është një kinazë proteine ​​e aktivizuar nga mitogjeni që shërben si një rregullator kyç gjatë metastazës së TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 mund të aktivizojë rrugë të shumëfishta sinjalizimi që çojnë në metastazën e TNBC-së. Për shembull, rruga c-Jun N-terminale kinazë (JNK) rregullon lëvizshmërinë qelizore dhe degradimin e matricës jashtëqelizore, dhe MLK3 aktivizon rrugën JNK, duke rritur kështu lëvizshmërinë e qelizave dhe duke u dhënë veti invazive (Rattanasinchai dhe Gallo, 2016). MLK3 gjithashtu rregullon EMT-në. Për ta bërë këtë, ajo aktivizon faktorët e transkriptimit në rrjedhën e poshtme si Snail, Slug dhe Twist. Këta faktorë pengojnë shprehjen e shënjuesve epitelialë dhe nxisin shprehjen e shënjuesve mezenkimalë, duke çuar në përvetësimin e një fenotipi metastatik (Casalino et al., 2023). MLK3 është vërejtur të luajë një rol në rimodelimin e ECM-së dhe aktivizimin e proteazave të tilla si metaloproteinazat e matricës (MMP) që degradojnë ECM-në. Kjo lehtëson pushtimin e qelizave tumorale dhe përhapjen në vende të largëta (Katari et al., 2019). Kështu, studimet e mëparshme kanë treguar se MLK3 luan një rol kritik në TNBC. Rattanasinchai dhe Gallo përdorën modele TNBC për të studiuar rolin e MLK3 dhe zbuluan se ai nxit zhvillimin e kancerit përmes shtigjeve specifike të sinjalizimit. Ata përdorën CRISPR/Cas9n për të modifikuar MLK3 dhe vunë re një reduktim të ndjeshëm në metastazën e TNBC (Rattanasinchai dhe Gallo, 2016).
dCas9, shpesh i quajtur Cas9 joaktiv, është një formë derivate e modifikuar e proteinës Cas9. Ndryshe nga Cas9 aktiv, dCas9 nuk ka aktivitet endonukleaze, duke e bërë atë të paaftë për të shkaktuar thyerje të dyfishta të ADN-së. Prandaj, dCas9 mund të përdoret për të synuar me saktësi rajone specifike të gjenomit pa ndonjë ndryshim ose modifikim në sekuencën e ADN-së (Wang et al., 2016). Në dCas9, dy proteina endonukleaze, RuvC dhe HNH, inaktivizohen duke shtypur mbetjet e rëndësishme të aminoacideve. (Richter et al., 2016). Pavarësisht mungesës së aktivitetit të copëtimit të ADN-së, dCas9 luan një numër rolesh të rëndësishme në kërkimin gjenetik dhe bioteknologjinë. Për shembull, ai lejon vizualizimin e rajoneve specifike të gjenomit, lehtëson rregullimin transkriptues dhe promovon modifikimet epigjenetike (Brocken et al., 2018).
Faktori i transkriptimit ZEB1 (homeobox 1 i lidhjes së E-box-it të gishtit të zinkut) luan një rol specifik dhe kritik në ndërmjetësimin e tranzicionit epitelial-mezenkimal (EMT), një proces qelizor që ndodh gjatë zhvillimit embrional, riparimit të indeve dhe përparimit të kancerit. Ai përfshin transformimin e qelizave epiteliale në qeliza mezenkimale, duke rezultuar në ndryshime në morfologjinë e qelizave, lëvizshmërinë, invazivitetin, etj. (Wu et al., 2020). ZEB1 pengon shënjues të shumtë epitelialë, siç janë E-kadherina dhe Okludina, të cilët janë përgjegjës për ruajtjen e ngjitjes qelizë-qelizë dhe polaritetit të qelizave epiteliale në TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Përveç kësaj, ZEB1 aktivizon shënjues të caktuar siç janë N-kadherina, vimentina dhe fibronektina (Konradi et al., 2014) dhe gjithashtu rregullon gjenet e përfshira në rimodelimin e citoskeletit siç janë Rho GTPazat dhe metaloproteinazat e matricës (MMP) (Huang). et al., 2014). 2022), përveç kësaj, ai ndikon gjithashtu në rrugë të ndryshme sinjalizuese siç është faktori transformues i rritjes-β (TGF-β), sinjalizimi Wnt, etj., duke nxitur kështu pushtimin e tumorit dhe metastazën në TNBC (Chen et al., 2016). Studime të shumta dhe prova shkencore tregojnë se ZEB1 ka potencial të madh si një agjent i vlefshëm për zbulimin dhe ndërhyrjen terapeutike të TNBC. Në një studim të kohëve të fundit, Waryah et al. përdorën një model TNBC dhe arritën shtypjen e plotë të ZEB1 nga dCas9. Kështu, ata vunë re specifikë shumë të lartë dhe frenim pothuajse të plotë të ZEB1 në kushte in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 është një mjet për redaktimin e gjeneve i quajtur CRISPR/Cpf1. Ai rrjedh nga sistemi CRISPR/Cas, ku termi Cas12 i referohet proteinës 12 të lidhur me CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), e cila është plotësisht e ngjashme me Cas9. E vetmja ndryshim është se përmban proteinën Cas12. Krahasuar me Cas9, Cas12 ka disa funksione unike, të tilla si gjenerimi i skajeve ngjitëse gjatë procesit të redaktimit të gjeneve, ndërsa Cas9 gjeneron skaje të topitura (Wang et al., 2021). Kjo veti e Cas12 kontribuon në teknologjinë e saj specifike të manipulimit të ADN-së. Si një proteinë e aftë për të njohur dhe prerë me saktësi ADN-në e synuar, ajo ka shkathtësi të jashtëzakonshme, duke e bërë atë një mjet efektiv për një sërë aplikimesh, duke përfshirë redaktimin e gjeneve (Pickar-Oliver dhe Gersbach, 2019).
Ngjashëm me variantet e tjera të CRISPR, CRISPR/Cas12 është gjithashtu i aftë të eliminojë ose aktivizojë gjenet në TNBC, duke synuar gjenet që luajnë një rol të rëndësishëm në patogjenezën e tij ose përgjigjen ndaj trajtimit (Yang dhe Zhang, 2023). Për të realizuar këtë proces, u zhvillua një ARN udhëzuese (gRNA) që drejton Cas12 drejt gjenit të synuar. Pasi Cas12 lidhet me objektivin e saj, ajo sjell ndërprerje të dyfishta të fijeve në ADN dhe aktivizon mekanizmat e riparimit të ADN-së. Gjatë procesit të riparimit, mund të përfshihen nukleotide të pasakta, duke çuar në mutacione gjenesh dhe humbje të funksionit (Zhang et al., 2021a). Përveç kësaj, një version i përmirësuar i enzimës Cas12 (i quajtur dCas12) u përdor gjithashtu për të aktivizuar gjenet. Duke e kombinuar atë me një aktivizues transkriptimi, është e mundur të induktohen gjene të caktuara, duke i aktivizuar ato kështu. Kjo teknologji ka potencial të madh në promovimin e aktivizimit të gjeneve shtypëse të tumorit (Sultan et al., 2022).
Redaktimi prime është një teknologji e sapozhvilluar dhe jashtëzakonisht superiore e redaktimit të gjenomit. Është e aftë të modifikojë ADN-në e një organizmi me shumë saktësi (Chen dhe Liu, 2023). Redaktimi prime arrihet përmes integrimit të dy komponentëve kryesorë: një enzimë e modifikuar CRISPR/Cas9 dhe transkriptaza e kundërt. Roli i enzimës CRISPR/Cas9 është të synojë në mënyrë selektive vendet e sakta në gjenom, ndërsa transkriptaza e kundërt ndihmon në modifikimin e plotë të ADN-së në vendndodhjen e synuar (Hassan et al., 2021). Në mekanizmin e redaktimit të prajmerëve, hapi i parë përfshin krijimin e një ARN-je udhëzuese të redaktimit të prajmerëve (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Ai përmban sekuencën e synuar dhe shabllonin e ARN-së që korrespondon me vendin e dëshiruar të redaktimit në ADN-në e synuar. pegRNA më pas futet në qelizat e synuara së bashku me një nukleazë redaktimi të prajmerëve (PE2). PE2 është një proteinë bashkimi e përbërë nga një enzimë Cas9, një transkriptazë e kundërt dhe një përshtatës redaktimi të prajmerëve (Martín-Alonso et al., 2021). Brenda qelizës, komplekset pegRNA dhe PE2 kërkojnë ADN-në specifike që duan të modifikojnë. Enzima Cas9 pret ADN-në dhe krijon një shabllon të përbërë nga fije të vetme (Choi et al., 2022). Transkriptaza e kundërt përdor këtë shabllon për të përgatitur ADN-në për redaktim. Së bashku me kopjimin e ADN-së, përfshihen edhe udhëzime për redaktimin e shabllonit të ARN-së. Së fundmi, fija e sapokrijuar e ADN-së përdoret si shabllon për të riparuar thyerjen në ADN, duke rezultuar në një sekuencë të ndryshuar të ADN-së që përmban modifikimin e dëshiruar (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mekanizmat e redaktimit të prajmerëve mund të çojnë në mutacione të përhapura në gjene. Mund të synojnë mutacionet pikësore, futjet, fshirjet dhe madje edhe zëvendësimet e gjeneve (Anzalone et al., 2019; Chen dhe Liu, 2023). Redaktimi primer ofron disa avantazhe krahasuar me teknologjitë e mëparshme të redaktimit të gjenomit. Këto përfshijnë saktësi të shtuar, efekte të reduktuara jashtë objektivit dhe aftësinë për të redaktuar ADN-në pa u mbështetur në thyerjet e dyfishta të ADN-së (Anzalone et al., 2020).
Teknologjia CRISPR/Cas9 u zhvillua fillimisht për të mbrojtur bakteret nga transferimi i plazmideve dhe infeksioni i fagut dhe më vonë u ripërdor si një mjet efektiv i shënjestrimit të ADN-së bazuar në ARN për redaktimin e gjenomit (Jiang dhe Doudna, 2017). Përveç kësaj, sistemi CRISPR/Cas9 është raportuar të jetë i pranishëm në 50% dhe 87% të gjenomeve bakteriale dhe arkeale, përkatësisht (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 është një mjet i mundshëm për fshirjen, futjen dhe korrigjimin e çdo sekuence gjenetike anormale duke përdorur mënyrat in vivo dhe in vitro (Sabit et al., 2021). Për më tepër, CRISPR/Cas9 është treguar të jetë pjesë e sistemit imunitar adaptiv për shkak të specifikës së tij për gjenet e synuara me interes (Chen dhe Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 përbëhet nga Cas9 dhe një ARN udhëzuese e vetme (sgRNA). Cas9 është një endonukleazë e përbërë nga përbërës të shumtë proteine. Përveç kësaj, Cas9 ka veti unike strukturore dhe konformacionale (Pacesa et al., 2022) pasi përbëhet nga dy lobe: njohja (REC) dhe nukleaza (NUC). Lobi REC ndahet më tej në tre rajone: REC1, REC2 dhe helikat e urës (Cromwell et al., 2018). NUC përbëhet nga tre lobe, përkatësisht RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH dhe domeni i ndërveprimit të motivit ngjitur të protospacerit (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA përbëhet nga dy përbërës, duke përfshirë ARN-në CRISPR (crRNA) dhe ARN-në e vogël transkoduese (ARN gjurmuese) (Figura 1). sgRNA lidh proteinën Cas9 me koneksinët për të formuar një kompleks aktiv, të njohur edhe si kompleksi efektor (Richter et al., 2012). crRNA është një çift bazash prej 18-20 nukleotidesh që luan një rol kritik në njohjen e sekuencave të ADN-së së synuar. Përveç kësaj, crRNA çiftëzohet me ADN-në e synuar, dhe tracrRNA vepron si një skelë për nukleazën Cas9 për t'u lidhur me ADN-në e synuar (Manghwar et al., 2019). Nga ana tjetër, sekuenca PAM ka 3 nukleotide, të cilat konfirmojnë, specifikojnë dhe ndërmjetësojnë lidhjen e kompleksit efektor me ADN-në. Nënnjësitë e kompleksit të proteinave Cas9 RuvC dhe HNH kanë aktivitet katalitik (Richter et al., 2012; Asmamaw dhe Zawdie, 2021). Domeni i nukleazës HNH i nënnjësisë Cas9 copëton fijen e ADN-së të shoqëruar me crRNA-në. Domeni i nukleazës RuvC copëton fijet e tjera të ADN-së dhe gjeneron thyerje të dyfishta të fijeve (DSB), pas të cilave aktivizohen dy mekanizma të ndryshëm të riparimit të thyerjes së ADN-së (Jiang dhe Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Përmbledhje e CRISPR/Cas9 (A). Komponentët e sistemit CRISPR/Cas9: (i). Endonukleaza Cas9 është përgjegjëse për prerjen e sekuencës së ADN-së së synuar, (ii) një ARN të vetme udhëzuese (sg) që rezulton nga bashkimi i kimerave crRNA dhe tra-crRNA. (dy). Cas9 përfshin disa komponentë si Rec I, Rec II, lobi NUC (HNH dhe Ruv C janë nënkomponentë) dhe domeni i ndërveprimit PAM (C) me funksione përkatëse. Kompleksi i proteinave CRISPR/Cas9 ndan sekuencat e ADN-së në forma jo-komplementare dhe komplementare (D). CRISPR/Cas9 modifikon gjenomin në tre faza: njohje, prerje dhe riparim. ARN-ja sg e projektuar udhëzon Cas9 dhe njeh sekuencën e dëshiruar përmes komponentit komplementar crRNA. Cas9 njeh sekuencën PAM në 5′-NGG-3′ dhe shkrin ADN-në, duke formuar një hibrid ADN-ARN dhe duke aktivizuar copëtimin. Domeni HNH i Cas9 copëton fijen plotësuese, dhe domeni RuvC copëton fijen jo-komplementare. CRISPR/Cas9 riparon dsADN-në duke e thyer atë në dy mënyra: bashkimi i skajeve jo-homologe (NHEJ) dhe riparimi i drejtuar nga homologjia (HDR). NHEJ riparon ADN-në me dy fije në mungesë të ADN-së homologe të huaj përmes një procesi enzimatik, një mekanizëm i prirur ndaj gabimeve që mund të fusë ose heqë sekuenca të rastësishme të ADN-së. HDR është shumë specifik dhe kërkon shabllone ADN-je homologe.
Shtigjet e riparimit të ndërmjetësuara nga CRISPR/Cas9 përfshijnë mekanizmat e bashkimit të skajeve jo-homologe (NHEJ) dhe riparimit të drejtuar nga homologjia (HDR). NHEJ është një rrugë e prirur ndaj gabimeve sepse përfshin futje ose fshirje dhe nuk kërkon ndonjë model gjatë mekanizmit të riparimit. Ai përdor nukleotide të rastësishme për të gjeneruar proteina standarde (Abbasi et al., 2021). Ky sistem riparimi përbëhet nga katër komplekse siç janë kompleksi KU, kompleksi i proteinave me plotësim të kryqëzuar tipi 4 (XRCC-4), enzima e përpunimit të skajeve të ADN-së dhe kinaza e proteinave DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Proteina komplekse KU ka dy nënnjësi, Ku 70 dhe Ku 80, dhe luan një rol të rëndësishëm në mekanizmin NHEJ, pasi mekanizmi i riparimit iniciohet nga lidhja e dy nënnjësive (Ku 70 dhe Ku 80) në skajet e topitura ose pothuajse të topitura të ADN-së së synuar (Abbasi et al., 2021), duke shërbyer si një skelë për të rekrutuar faktorë të tjerë të lidhur me NHEJ në vendin e dëmtimit (Yang et al., 2020). XRCC-4 dhe ligaza e ADN-së përbëhen nga 334 dhe 911 aminoacide, përkatësisht, dhe kompleksi XRCC4-DNA ligazë IV stimulon lidhjen e skajeve të ADN-së (Chatterjee et al., 2015). Enzima e përpunimit të skajeve të ADN-së, e njohur edhe si polinukleotide kinazë 3′-fosfat, është një enzimë e përpunimit të skajeve të ADN-së. Ajo mund të heqë grupin 3′P në ADN dhe të fosforilojë grupin 5′OH gjatë riparimit DSB. Gjithashtu përfshin riparimin e ndërprerjeve me një fije të vetme (SSB) duke përdorur rrugën e riparimit të SSB (Chatterjee et al., 2015). Kinaza e proteinave DNA-PKcs është një kinazë proteine ​​e varur nga ADN-ja që përbëhet nga një nën-njësi katalitike e PIKK-ve (kinazat e lidhura me fosfatidilinozitol 3-kinazën) dhe familjes së mutuar të ataksi telangiektazisë (ATM), si dhe ATR-ve të lidhura me ATM dhe Rad3, ndërprerjeve të fijeve (DSB) dhe ndërprerjeve me një fije të vetme (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR është një mekanizëm riparimi më i saktë dhe i përshtatshëm sepse informacioni kopjohet duke përdorur formën e paprekur të dupleksit homolog të ADN-së, megjithëse kërkon praninë e kromatideve motra. Kjo ndodh gjatë fazës S/G2 të ciklit qelizor të gjitarëve. HDR ndodh kryesisht në speciet e majave, por NHEJ është kritik tek gjitarët (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Mekanizmi i plotë i riparimit tregohet në Figurën 1.
Meqenëse TNBC shkaktohet nga anomali gjenetike dhe epigjenetike, korrigjimi i anomalive malinje gjenomike/epigjenomike duke përdorur CRISPR/Cas9 mund të jetë një qasje terapeutike e arsyeshme (Chen et al., 2019). Përveç kësaj, disa faktorë transkriptimi të përfshirë në rregullimin transkriptues specifik të qelizave mund të shfaqin karakteristika unike të qelizave kancerogjene, duke sugjeruar që rregullimi transkriptues mund të jetë një qasje e shkëlqyer për trajtimin e kancerit (Drost et al., 2017). Shfrytëzimi i këtyre karakteristikave molekulare të tumoreve, siç janë defektet gjenetike, epigjenetike dhe transkriptuese, për zhvillimin e barnave mund të përmirësojë rezultatet klinike dhe të zvogëlojë kostot e shqyrtimit. CRISPR është një mjet potencial për redaktimin e gjeneve që jo vetëm që mund të zbulojë dhe identifikojë objektivat gjenomikë që shkaktojnë kancer, por mund të përdoret gjithashtu për të redaktuar, shtypur dhe modifikuar epigjenetikisht onkogjenet në qelizat njerëzore (Tabela 1) (Ahmed et al., 2021). Disa shqyrtime CRISPR janë kryer për të kërkuar gjenet e shoqëruara me shtypësit e tumorit, onkogjenet dhe rezistencën ndaj ilaçeve. Përdorimi i CRISPR/Cas9 për të modifikuar onkogjene të ndryshme TNBC është treguar në Figurën 2.
Figura 2. Redaktimi i gjeneve të onkogjeneve të ndryshme të TNBC duke përdorur CRISPR/Cas9 që rezulton në uljen e rritjes dhe metastazës së tumorit. Këto onkogjene përfshijnë CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 dhe CXCR7, Crypto1, ROR1 dhe ST8SIA, të cilat janë të përfshira në shfaqjen dhe metastazën e TNBC.
Migrimi, pushtimi dhe tranzicioni epitelial-mezenkimal (EMT) i qelizave kancerogjene shoqërohen me ITGA9. Studimet e mëparshme kanë treguar se ITGA9 është një lojtar kyç në rrugën Notch dhe luan një rol interesant në metastazën e rabdomiosarkomës (Molist et al., 2020). Përveç kësaj, ITGA9 u zbulua se është i lidhur ngushtë me prognozën e pacientit në disa lloje tumoresh, përfshirë kancerin e gjirit (Wang Z. et al., 2019). Përveç kësaj, analiza bioinformatike e ITGA9 tregoi se shprehja e saj në TNBC ishte dukshëm më e lartë se në nëntipet e tjera të kancerit të gjirit. Nivelet e larta të ITGA9 shoqërohen me metastazë të tumorit dhe rikthim të sëmundjes tek pacientët me TNBC. Zhdukja e ITGA9 nga CRISPR/Cas9 rezultoi në veti të ngjashme me qelizat staminale të kancerit (CSC), angiogjenezë të tumorit, rritje të tumorit dhe ulje të metastazës duke nxitur degradimin e β-kateninës në TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 është një anëtar i familjes TGF-β dhe është kritik për embriogjenezën e hershme, mirëmbajtjen e qelizave staminale dhe metastazën e kancerit (Ishii et al., 2021). I njohur gjithashtu si Tdgf-1, është një proteinë sinjalizuese onkogjene e ankoruar nga GPI e përfshirë në rregullimin e formimit të vijës primitive, mezodermës dhe endodermës, si dhe në krijimin e asimetrisë majtas/djathtas në zhvillimin e organeve të trupit gjatë embriogjenezës (Zhang et al., 2021b). Për më tepër, Cripto-1 është treguar se është i përfshirë në tranzicionin epitelial-mezenkimal (EMT) si një shënues i qelizave staminale (Zhang et al., 2021b). EMT është kritik jo vetëm për procese të ndryshme si zhvillimi embrional, fibroza dhe shërimi i plagëve, por edhe për pushtimin dhe metastazën e kancerit. Për më tepër, Cripto-1 është treguar se bashkëvepron me katër receptorë Notch dhe rrit maturimin e tyre post-përkthyes (Brandstadter dhe Maillard, 2019). Rruga e sinjalizimit Notch dihet se është e përfshirë në mirëmbajtjen e qelizave të kancerit të gjirit tek njerëzit. Studimet kanë treguar se eliminimi i Crypto-1 i ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 pengon rritjen dhe metastazën e kancerit. Prandaj, Crypto-1 mund të bëhet një objektiv i rëndësishëm terapeutik për TNBC (Castro et al., 2015).
Proteina XCL12 dhe receptori i saj i kemokinës CXC (CXCR4 dhe CXCR7) luajnë role të ndryshme në përhapjen, rritjen, migrimin dhe pushtimin e qelizave kancerogjene (Wu et al., 2015). Këta kemoreceptorë janë shoqëruar me zhvillimin e TNBC përmes rrugëve të shumëfishta të sinjalizimit si në modelet in vivo ashtu edhe në ato in vitro (Wu et al., 2015). Përveç kësaj, aktivizimi i CXCR4 dhe CXCR7 shoqërohet me një ndjeshmëri më të madhe ndaj metastazës dhe prognozë të dobët në TNBC (Karn et al., 2022). Prandaj, eliminimi i CXCR4 dhe CXCR7 mund të bëhet një gjen efektiv i synuar i ilaçit për trajtimin e kancerit të gjirit, përfshirë TNBC. Studimi nga Yang et al. Yang et al (2019) përdori CRISPR/Cas9 për të eliminuar së bashku gjenet CXCR4 dhe CXCR7 dhe zbuloi se përhapja, rritja, migrimi dhe pushtimi i TNBC u penguan ndjeshëm (Yang et al., 2019).
Nivele të rritura të miR-3662, një onkogjen i TNBC, u vunë re në indet e kancerit të gjirit (Yi et al., 2022). Është treguar se ulja e miR-3662 pengon rritjen dhe metastazën e tumorit të kancerit të gjirit si in vivo ashtu edhe in vitro (Agarwal dhe Gupta, 2021). HBP-1 është një frenues i fuqishëm i sinjalizimit Wnt/-catenin dhe ka të ngjarë të jetë përgjegjës për rritjen e qelizave TNBC të ndërmjetësuara nga miR-3662. Kohët e fundit, Yi et al. zbuluan se boshti miR-3662-HBP1 rregullon rrugën e sinjalizimit Wnt/-catenin në qelizat TNBC (Yi et al., 2022). Për shkak të shprehjes së tij specifike për tumorin, miR-3662 mund të jetë një objektiv i mundshëm terapeutik për TNBC. Kështu, ulja e miR-3662 e ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 mund të jetë një qasje e shkëlqyer për zhvillimin e barnave të reja për trajtimin e TNBC.
UBR5 është një nukleofosfoproteinë 300 kDa që është identifikuar si një rregullator kyç i tumorogjenezës, metastazës dhe përgjigjes imune në kancere të ndryshme (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 është raportuar të jetë shumë i rritur në mostrat TNBC dhe stimulon funksionin e ERα duke nxitur përhapjen përmes aktivitetit të saj të ligazës ubikuitinë (Bolt et al., 2015). Studimet e sekuencimit të të gjithë ekzomit të mostrave primare TNBC treguan gjithashtu shprehje të rritur të UBR5, duke sugjeruar rolin e saj në zhvillimin e TNBC. Përveç kësaj, fshirja e UBR5 e nxitur nga CRISPR/Cas9 tregoi frenim të konsiderueshëm të metastazës dhe rritjes së TNBC në modelet eksperimentale të miut. Për më tepër, përfshirja e UBR5 në një model miu të tipit të egër riktheu funksionalitetin e tij të plotë, ndërsa ky efekt nuk u vu re në llojet mutante të inaktivizuara (Liao et al., 2017). Mungesa e UBR5 shoqërohet me rritje të apoptozës, nekrozës dhe frenimit të rritjes së tumorit në TNBC për shkak të angiogjenezës së dobët. Për shkak të humbjes së UBR5, përhapja e tumorit në organet e largëta zvogëlohet, dhe UBR5 shkakton EMT anormale kryesisht duke zvogëluar shprehjen e E-kadherinës (Zhang dhe Weinberg, 2018). Kohët e fundit, UBR5 u tregua të jetë një faktor shumë i rëndësishëm në transkriptimin e PDL1 të induktuar nga IFN-γ në TNBC për shkak të mungesës së aktivitetit të ubikuitinimit të E3. Analiza e transkriptomës së ARN-së zbuloi se UBR5 mund të ketë efekte sistemike në gjenet e shoqëruara me rrugën IFN-γ dhe të nxisë transaktivizimin e PDL1 duke rritur nivelet e aktivizimit të ARN-së së kinazës së proteinave (PKR) dhe transduktorëve dhe aktivizuesve të sinjalit të saj. transkriptimi 1 (STAT1) dhe faktori rregullator i interferonit 1 (IRF1). Megjithatë, ablacioni i kombinuar i shprehjes së UBR5 dhe PD-L1 i ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 ka një efekt terapeutik sinergjik sesa çdo bllokadë veçmas, me efekte të thella në mikroambientin e tumorit (Wu et al., 2022). Kështu, CRISPR/Cas9 mund të jetë një mjet i rëndësishëm për të penguar funksionin e UBR5, duke shtypur kështu metastazën e TNBC dhe rritjen e tumorit.
ROR1 është një proteinë transmembranore e tipit I që shprehet gjatë kancerit dhe zhvillimit embrional dhe është identifikuar si një proteinë onkofetale (Nicholas Borcherding, 2014). Sjellja invazive e kancereve të ndryshme njerëzore shoqërohet me rritjen e ROR1. Rezultate premtuese janë marrë nga studimet in vivo dhe in vitro që përfshijnë komponime terapeutike që synojnë ROR1 (Chien et al., 2016). Nivelet e larta të ARNi-së së ROR1 në biopsitë e indeve të gjirit janë shoqëruar gjithashtu me tumore agresive të gjirit bazal-të ngjashëm (BL) dhe migrimin e tyre në pjesë të tjera të trupit. Për më tepër, shprehja e tepërt e ROR1 është identifikuar si një shënues prognostik për zhvillimin e TNBC (Chien et al., 2016). Megjithatë, heshtja e ROR1 duke përdorur CRISPR/Cas9 për të shtypur rritjen dhe metastazën e TNBC do të ishte një strategji efektive.
Procesi i sialilimit përfshin shtimin e acidit sialik në gliko-konjugate, i cili katalizohet nga sialiltransferazat (ST). ST8SIA1 i përket familjes ST dhe luan një rol të rëndësishëm në patogjenezën e sëmundjeve të ndryshme si leuçemia limfocitike dhe kanceri kolorektal (Chang et al., 2018). Analiza e sekuencës së ARN-së tregon se ST8SIA1 shprehet shumë në indin e gjirit të pacientëve me TNBC dhe është pozitivisht i korreluar me mutacionet në gjenin shtypës të tumorit p53, i cili mund të kontribuojë në patogjenezën e TNBC (Battula et al., 2017). Përveç kësaj, ST8SIA1 është i përfshirë në metastazën dhe përsëritjen e TNBC, duke sugjeruar se luan një rol të rëndësishëm në shfaqjen dhe zhvillimin e TNBC. Në një model in vitro të TNBC, u tregua se rrëzimi i ST8SIA1 nga CRIPSR/Cas9 bllokon rritjen dhe metastazën (Battula et al., 2017). Kjo sugjeron që CRISPR/Cas9 mund të jetë një mjet i rëndësishëm për frenimin e funksionit të onkogjenit ST8SIA1 në trajtimin e TNBC.
NAT1 është një enzimë metabolike që katalizon formimin e komponimeve ksenobiotike të fazës II dhe shprehet në pothuajse të gjitha indet njerëzore. NAT1 mund të përdorë kofaktorin folat për të synuar acetil-CoA (acetil-CoA) edhe në mungesë të substratit aromatik të aminës (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studimet kanë treguar se NAT1 rregullon funksionin e metaloproteinazës 9 të matricës (MMP9) në modelet e qelizave të kancerit të gjirit dhe mbron nga speciet reaktive të oksigjenit (ROS) gjatë mungesës së glukozës (Wang et al., 2018). Fshirja e NAT1 është treguar se pengon kompleksin e piruvat dehidrogjenazës, duke çuar në mosfunksionim mitokondrial (Wang L. et al., 2019). Përveç kësaj, raporte të tjera të ndryshme kanë treguar se frenimi i NAT1 duke përdorur molekula të vogla dhe heshtjen e siRNA mund të zvogëlojë invazivitetin dhe përhapjen e qelizave të kancerit të gjirit (Stepp et al., 2018). Kohët e fundit, CRISPR/Cas9 u përdor për të shtypur NAT1 në linjën qelizore të kancerit të gjirit MDA-MB-231, duke ndikuar në metabolizmin qelizor në varësi të nivelit të shprehjes së tij. Ky studim tregoi gjithashtu se NAT-1 është kritik për përparimin dhe metastazën e TNBC (Carlisle et al., 2020).
Transkriptimi i koordinuar i onkogjeneve rregullohet nga superpërmirësues, faktorë transkriptimi dhe kofaktorë (Hnisz et al., 2015). Përveç kësaj, një grup kinazash të varura nga ciklina (CDK), të tilla si CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 dhe CDK13, janë të nevojshme për rregullimin transkriptues. Midis tyre, CDK7 është e përfshirë në fosforilimin e ARN polimerazës II, e cila është shumë e rëndësishme për fillimin dhe zgjerimin e transkriptimit të onkogjeneve në patogjenezën e TNBC. Në një studim themelor, fshirja e CDK7 nga CRISPR/Cas9 pengoi TNBC, duke treguar se patogjeneza e TNBC varet nga CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Studimet kanë treguar se mutacionet në MYC dhe RBP (proteina që lidhet me ARN-në) mund të çojnë në apoptozë, ndërsa mutacionet e një gjeni të vetëm në MYC ose RBP nuk ndikojnë në rritjen e qelizave kancerogjene (Einstein et al., 2021). Më shumë se 1000 RBP në gjenomën njerëzore janë shqyrtuar duke përdorur një bibliotekë të bazuar në CRISPR/Cas9. Midis tyre, 57 RBP u gjetën të jenë kritike për rritjen e qelizave kancerogjene me nivele shumë të larta të MYC (Wheeler et al., 2020). Përveç kësaj, YTHDF2 është i rëndësishëm për ruajtjen e rritjes së qelizave TNBC dhe zvogëlon sasinë e transkripteve të metiluara gjatë transkriptimit dhe përkthimit të nivelit të lartë në qelizat kancerogjene me shprehje më të lartë të MYC. Përveç kësaj, YTHDF2 nuk është thelbësor për qelizat kancerogjene, të cilat janë më pak të varura nga nivelet e larta të MYC për të zgjatur mbijetesën e pacientëve me TNBC (Einstein et al., 2021), duke sugjeruar se mund të jetë një objektiv i mundshëm terapeutik për ilaçet që mund të kapërcejnë TNBC.
Proteinat e gishtit të zinkut (ZNF) përbëjnë afërsisht 1% të gjenomit të përgjithshëm njerëzor. Studimet kanë treguar se ZNF mund të rregullojë përhapjen e qelizave në kancere të ndryshme, të tilla si kanceri i mëlçisë, kanceri i gjirit dhe kanceri kolorektal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Bibliotekat e gjeneruara nga CRISPR knockout janë përdorur për të shqyrtuar gjene të ndryshme shtypëse të tumorit (TSG) në qelizat e kancerit të gjirit (Shalem et al., 2014). Që atëherë, një studim transkriptomik i qelizave të kancerit të gjirit të fshira nga ZNF319 CRISPR/Cas9 ka treguar se ZNF319 është një gjen shtypës i tumorit që zvogëlon përhapjen e kancerit të gjirit dhe për këtë arsye është i përfshirë në mekanizma të ndryshëm të mundshëm sinjalizimi dhe funksione të tjera biologjike (Wang L. et al., 2022).
Ferroptoza është një lloj vdekjeje qelizore e programuar që varet nga prania e hekurit. Dihet që zhvillimi i feroptozës ndikohet nga prania e peroksideve të lipideve. Përveç kësaj, është raportuar se PKCβII shfaq peroksidim të hershëm të lipideve, dhe rritja e peroksidimit të lipideve shoqërohet me feroptozë. Shqyrtimi i një biblioteke të frenuesve të kinazës të ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 zbuloi se PKCβII është i përfshirë në procesin e peroksidimit të lipideve, i cili është kritik për feroptozën në qelizat MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Prandaj, kjo sugjeron që eliminimi i PKCβII nga CRISPR/Cas9 mund të jetë një objektiv i mundshëm i gjenit shtypës të tumorit për trajtimin e sëmundjeve të lidhura me feroptozën (Zhang et al., 2022).
Rezistenca ndaj ilaçeve besohet të jetë përgjegjëse për afërsisht 90% të vdekjeve tek pacientët me kancer dhe është një nga sfidat kryesore në trajtimin e kancerit (Bukowski et al., 2020). Rezultatet tregojnë se një numër i mjaftueshëm gjenesh që lidhen me rrjedhjen e ilaçeve, riparimin e ADN-së, apoptozën dhe shtigje të ndryshme të sinjalizimit qelizor janë të lidhura me rezistencën ndaj ilaçeve (Haider et al., 2020). Midis tyre, disa gjene janë shënjestruar nga mjetet CRISPR/Cas9 dhe kanë treguar rezultate premtuese në uljen e rezistencës ndaj ilaçeve dhe rritjen e efektivitetit të trajtimeve kundër kancerit (Vaghari-Tabari et al., 2022). Përveç kësaj, bibliotekat e shqyrtimit të gjeneve CRISPR/Cas9 me rendiment të lartë janë implikuar në modifikimin e funksionit të gjeneve të synuara potencialisht të rezistencës ndaj ilaçeve (Shalem et al., 2015). Për të identifikuar gjenet e rezistencës ndaj paklitakselit, sekuencimi i ARN-së i shoqëruar me shqyrtimin e bibliotekës së sgRNA-së në të gjithë gjenomin u përdor për të identifikuar tetë gjene kandidate, duke përfshirë deacetilazën e histonit 9 (HDAC9), që shoqërohen me rezistencën ndaj ilaçeve tek pacientët me TNBC të përsëritur (B et al., 2020). Në një studim tjetër, u vu re një rritje e shprehjes së diserinës/treoninës dhe proteinës kinazës së tirozinës (DSTYK) gjatë mbijetesës së pacientëve me TNBC të trajtuar me ilaçe antikanceroze. Për më tepër, ulja e DSTYK e ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 rriti ndjeshëm apoptozën e qelizave kancerogjene rezistente ndaj ilaçeve in vitro (qelizat SUM102PT dhe qelizat MDA-MB-468) dhe një model TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Edhe pse TNBC ka aktivizim jonormal të rrugës MAPK, efekti klinik i terapive të synuara nga MEK është i dobët. Një shqyrtim i bibliotekës gjenomike CRISPR/Cas9 zbuloi se frenimi i PSMG2 (shaperoni 2 i montimit të proteomës) sensibilizon qelizat TNBC BT549 dhe MB468 ndaj frenuesit MEK AZD6244. Rënia e PSMG2 nga CRISPR/Cas9 ndryshoi funksionin normal të proteazomës, duke çuar në çmontimin e PDPK1 të ndërmjetësuar nga autofagjia, duke përmirësuar kështu më tej qelizat tumorale në modelet e miut TNBC të induktuara nga AZD6244 (frenuesi MEK) dhe MG132 (frenuesi i proteazomës). Kështu, frenuesit e proteazomës dhe kinazës MAP (MEK) mund të administrohen në mënyrë sinergjike për të zvogëluar përhapjen e qelizave tumorale (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 është përdorur gjithashtu për të kontrolluar humbjen e funksionit të gjenit që çon në rezistencë ndaj TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. shpjeguan mekanizmin e rezistencës ndaj ilaçeve të qelizave kancerogjene të trajtuara me JQ1, një frenues i bromodomainës BET (BBDI), në TNBC. Duke përdorur CRISPR/Cas9, ata zbuluan se fshirja e gjenit rb1 bëri që TNBC të bëhej rezistente ndaj ilaçit antikancerogjen JQ1. Prandaj, funksioni rb1 është i rëndësishëm në përgjigjen ndaj ilaçeve JQ1 në TNBC. Ata gjithashtu raportuan se paklitakseli është një frenues i kinazës/mikrotubulave CDK4/6, dhe kombinimi i tij me BBDI si JQ1 mund të ofrojë përgjigje terapeutike premtuese ndaj TNBC rezistente ndaj ilaçeve (Ge et al., 2020).
Peizazhi transkriptues i ARN-së së gjatë jo-koduese (lncRNA) është raportuar të jetë përgjegjës për rezistencën ndaj terapisë neoadjuvante në TNBC. Ky studim tregon se pesë transkripte të ndryshme të lncRNA-së MALAT1 shprehen shumë në TNBC. Përveç kësaj, fshirja e MALAT1 e ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 rriti ndjeshmërinë e qelizave BT-549 të TNBC ndaj paklitakselit dhe doksorubicinës, duke sugjeruar një rol të mundshëm për rezistencën ndaj MALAT1 në TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutacionet në BRCA1 (BRCA1m) janë heterogjene dhe për këtë arsye të vështira për t'u zbuluar. Synimi i PARP1 (poli(ADP-ribozë) polimeraza), partneri sintetik vdekjeprurës i BRCA1, mund të rrisë ndjeshmërinë kemoterapeutike ndaj ilaçeve të TNBC. Duke përdorur CRISPR/Cas9, fshirja e PARP1 rriti ndjeshmërinë e ilaçeve antikanceroze si doksorubicina, gemcitabina dhe docetakseli ndaj qelizave mutante të TNBC mBRCA1, duke sugjeruar që PARP1 është gjithashtu i përfshirë në rezistencën ndaj ilaçeve në TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutacionet në gjenet shtypëse të tumorit BRCA1 ose BRCA2 dihet se rrisin mundësinë e zhvillimit të kancerit të gjirit tek njerëzit. Trajtimi i këtyre pacientëve kërkon përdorimin e frenuesve të PARP. Për më tepër, është demonstruar se heqja e faktorit të shpëtimit të nukleotideve DNPH1 duke përdorur CRISPR/Cas9 mund të largojë monofosfatin toksik të nukleotidit 5-hidroksimetildeoksiuridinës (hmdU), duke rritur kështu përgjigjen e qelizave me mungesë të BRCA ndaj ndjeshmërisë ndaj frenuesve të PARP (Fugger). et al., 2021). Kështu, frenuesit CRISPR/Cas9 dhe PARP1 mund të bëhen një strategji e rëndësishme trajtimi për TNBC.
Gjeni i glikoproteinës depërtuese (P-gp) është një gjen i rezistencës ndaj shumë ilaçeve që në përgjithësi është i rritur në afërsisht 41% të të gjitha TNBC-ve (Sun et al., 2020). Dalja e ilaçeve e shkaktuar nga P-gp është identifikuar si një rregullator kyç i rezistencës ndaj ilaçeve në kancerin e gjirit. Frenuesit e P-gp kanë demonstruar ndjeshmëri të shtuar ndaj ilaçeve antikanceroze në kancerin e gjirit (Famta et al., 2021). Kështu, ablacioni ose shtypja e P-gp dhe frenuesve të P-gp të ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 mund të jenë metoda shumë të rëndësishme për të kapërcyer rezistencën ndaj ilaçeve në TNBC.
Transportuesi i kasetave G2 që lidhet me ATP (ABCG2) dihet se shkakton rezistencë ndaj ilaçeve në TNBC (Palasuberniam et al., 2015), megjithëse aktualisht nuk ka raportime mbi marrëdhënien midis heshtjes së CRISPR/Cas9 dhe ABCG2 dhe inaktivizimit të gjenit shtypës të tumorit. PTEN mund të rrisë aktivizimin e ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Prandaj, përdorimi i CRISP/Ca9 për të hequr ABCG2 dhe kombinimi i tij me një frenues të ABCG2 mund të jetë një trajtim i përshtatshëm për të kapërcyer rezistencën ndaj ilaçeve në TNBC. Tabela 2 përmend CRISPR/Cas9 që synon të gjitha gjenet e rezistencës.
Tabela 2. CRISPR/Cas9 synon gjene të ndryshme të rezistencës ndaj TNBC për të sensibilizuar qelizat ndaj barnave antikancerogjene.
Bibliotekat CRISPR/Cas9 janë mjete të mundshme për shqyrtimin e mutacioneve të gjeneve të shoqëruara me patogjenezën e kancerit (Chan et al., 2022). Kjo metodë shqyrtimi përfshin katër hapa, siç janë (a) ndërtimi i bibliotekës, (b) transduksioni lentiviral, (c) shqyrtimi fenotipik dhe (d) analiza e gjenit të synuar. Edhe pse TNBC ka aktivizim jonormal të rrugës MAPK, prognoza klinike e terapisë së synuar MEK për pacientët me TNBC që mbajnë mutacione në gjenet shtypëse të tumorit, siç janë PTEN, RB1 dhe TP53, është shumë e dobët.
Për më tepër, një skrining me nokaut të gjenit duke përdorur CRISPR/Cas9 testoi molekulën më të fuqishme dhe selektive, dehidrokatrolin, i cili është i bollshëm në ekstraktet e luleve dhe gjetheve të Guatemalës, për të kuptuar efektin e dehidrokatrolit në MDA-MB-231. Mekanizmat e citotoksicitetit qelizor selektiv. Karakteristikat e kërcellit mezenkimal të nëntipeve TNBC. Ky skrining i bazuar në CRISPR/Cas9 zbuloi gjithashtu se HSD17B11, një gjen që kodon 17β-hidroksisteroid dehidrogjenazën e tipit 11, shprehet shumë në qelizat MDA-MB-231 dhe rezulton në dehidrofalkarinol specifik për qelizat MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Kështu, kjo sugjeron që skriningu gjenomik CRISPR/Cas9 ka potencial të madh në identifikimin e mekanizmave që qëndrojnë në themel të vetive antikancerogjene të komponimeve të mundshme natyrore.
Përveç kësaj, ndjeshmëria e TNBC ndaj kancerit u studiua duke përdorur një skrining të paanshëm CRISPR/Cas9 në të gjithë gjenomin in vivo, i cili tregoi një lidhje midis rrugëve onkogjene dhe atyre shtypëse të tumorit. Komponentët kryesorë të rrugëve mTOR dhe Hippo janë raportuar të luajnë role të rëndësishme në rregullimin e tumorit në TNBC. Përveç kësaj, studimet kanë treguar se frenimi farmakologjik i onkoproteinës mTORC1/2 dhe YAP pengon në mënyrë efektive patogjenitetin e TNBC duke përdorur një model sinergjie të matricës së ilaçit in vitro dhe ksenografte të nxjerra nga pacienti in vivo. Për më tepër, frenimi i mTORC1/2 i ndërmjetësuar nga Torin-1 rrit makropinocitozën, ndërsa frenimi i YAP i shkaktuar nga verteporfina çon në vdekjen e qelizave të TNBC. Të marra së bashku, këto rezultate nxjerrin në pah fuqinë dhe qëndrueshmërinë e skriningut CRISPR in vivo në të gjithë gjenomin për të identifikuar trajtime të reja dhe efektive për TNBC (Dai et al., 2021).
Çrregullimi i sistemit imunitar është një faktor i rëndësishëm në tumorogjenezën. Qelizat kancerogjene i shmangen pastrimit imunitar duke anashkaluar mekanizmat mbrojtës, duke përfshirë ndërhyrjen në aktivitetin e qelizave imune në mikroambientin e tumorit dhe duke kompromentuar sistemin imunitar. Prandaj, zhvillimi i një sistemi imunitar të përmirësuar mund të jetë një qasje kyçe për të luftuar tumoret. Përdorimi i modifikimit të gjenit të bazuar në CRISPR/Cas9 adreson disa çështje që lidhen me mosfunksionimin imunitar nga perspektiva të ndryshme. CRISPR/Cas9 është përdorur për të përmirësuar imunitetin antitumor kundër kancerit të gjirit përmes rrugëve të mëposhtme (Figura 3).
Figura 3. Imunoterapia CRISPR/Cas9 synon qelizat TNBC. Humbja e CDK5 dhe rrëzimi i PDL1 dhe CD155 forcon sistemin imunitar. Po kështu, humbja e A2AR dhe rrëzimi i TAA-ve si HER2, mucina 1 dhe TEM8 rriti efikasitetin e qelizave CAR-T në vrasjen e qelizave kancerogjene. Shqyrtimi i qelizave T i drejtuar nga CRISPR/Cas9 ka treguar se ndërprerja e kinazës p38 rrit aktivitetin antitumor të qelizave T. Qelizat T të modifikuara nga CRISPR/Cas9 rrisin shprehjen e TCR (receptori i qelizave T), duke rezultuar në qeliza T që kanë aktivitet antitumor.
Qëllimi i imunoterapisë është të stimulojë sistemin imunitar për të sulmuar qelizat kancerogjene. Mbishprehja e proteinave të pikave të kontrollit imunitar zakonisht parandalon reaksionet autoimune, por mund të ndihmojë kanceret t'i shmangin ato (Topalian et al., 2015). Këto proteina parandalojnë reaksionet imunitare duke u lidhur me receptorët në sipërfaqen e qelizave imunitare. Proteina të shumëfishta të pikave të kontrollit (si CD155 dhe PD-L1) synojnë receptorin PD-1 në qelizat imunitare dhe shprehen në kancerin e gjirit, veçanërisht në kancerin e gjirit (TNBC) (Li Y.-C. et al., 2020). Ulja e PD-L1 ose receptorit të tij duke përdorur CRISPR/Cas9 mund të stimulojë sistemin imunitar për të sulmuar tumoret e TNBC (Yahata et al., 2019). Për më tepër, ulja e shprehjes së PD-L1 përmes fshirjes së CDK5 të ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 është treguar se pengon rritjen e tumorit in vitro dhe in vivo (Deng et al., 2020). Frenimi i rritjes në modelet in vitro dhe in vivo të kancerit të gjirit sugjeron që reduktimi i CD155 i ndërmjetësuar nga shRNA mund të ketë një efekt terapeutik në kancerin e gjirit (Gao et al., 2018).
Qelizat CAR T shprehin CAR që njohin antigjenet e shoqëruara me tumorin (TAA) dhe mund të përdorin uljen e proteinave të pikave të kontrollit për të rritur aktivitetin e tyre (Li C. et al., 2020). Ekzistojnë objektiva të ndryshëm potencialë për terapinë e qelizave CAR T në kancerin e gjirit, duke përfshirë disa TAA si HER2, mucina1 dhe TEM8 (Bajgain et al., 2018). Ka prova që qelizat CAR T që synojnë mezotelinën (e shprehur tepër në qelizat TNBC BT-459) janë më efektive kundër kancerit kur PD-1 eliminohet duke përdorur CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Megjithatë, izolimi i qelizave T nga pacientët dhe më pas modifikimi i tyre ex vivo është një proces që kërkon shumë punë dhe kohë. Megjithëse qelizat T universale mund të zvogëlojnë kërkesat e izolimit, qelizat T donatore që shprehin antigjenin e leukociteve njerëzore (HLA) të klasës I dhe receptorin e qelizave T (TCR) duhet të hiqen për të parandaluar anomalitë e transplantit kundrejt strehuesit (Ren et al., 2017). , 2017a). Duke përdorur CRISPR/Cas9, HDR mund të eliminojë njëkohësisht TCR dhe HLA dhe të eliminojë gjenin që kodon CAR. Studimet kanë treguar se CRISPR/Cas9 mund të përdoret për të futur CAR anti-CD19 në lokusin TCR, duke prodhuar kështu në mënyrë efikase CAR pa varfëruar qelizat T (Dimitri et al., 2022). Teknologjitë multipleks janë zhvilluar për të gjeneruar qeliza T alogjenike CAR duke eliminuar njëkohësisht TCR, beta-2-mikroglobulinën (B2M), nën-njësinë HLA-I dhe proteina të tjera si PD-1 dhe CTLA-4, të cilat mund të kenë veti më të mëdha anti-kanceroze kundër TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Përdorimi i CRISPR/Cas9 mund të përmirësojë efektivitetin e qelizave CAR-T. Adenozina dihet se ka veti imunosupresive dhe mund të zvogëlojë imunitetin kundër kancerit duke bllokuar funksionin e qelizave T dhe duke aktivizuar receptorët A2A të adenozinës (A2AR) (Vigano et al., 2019). Heshtja e A2AR duke përdorur CRISPR/Cas9 përmirësoi ndjeshëm efikasitetin e qelizave CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Qelizat T dihet se shfaqin karakteristika të ndryshme fenotipike, të tilla si zgjerimi qelizor, diferencimi, stresi oksidativ dhe stresi gjenomik. Shqyrtimi i qelizave T bazuar në CRISPR/Cas9 zbuloi ndërprerjen e 25 kinazave të ndryshme të receptorëve të qelizave T. Midis tyre, fshirja e kinazës p38 është treguar se rrit aktivitetin antitumor të qelizave T, duke treguar se kinaza p38 është një rregullator kyç i rregullimit të qelizave CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Qelizat T mund të modifikohen gjenetikisht duke përdorur CRISPR/Cas9 për të prodhuar TCR me shprehje të lartë. Transferimi i qelizave T të modifikuara gjenetikisht te pacientët ka treguar aktivitet më të fortë antikanceroz sesa qelizat T endogjene. Prandaj, TCR-të endogjene mund të konkurrojnë me TCR-të e modifikuara gjenetikisht te pacientët, gjë që mund të ndikojë në potencialin e imunoterapisë kundër kancerit. Për të kapërcyer këtë problem, përdorimi i CRISPR/Cas9 për të hequr TCR-β endogjene në qelizat marrëse dhe më pas për të transferuar qelizat T TCR-β te pacientët me kancer mund të shfaqë përgjigje më të mira imune kundër kancerit pa pasur nevojë për konkurrencë seksuale të TCR endogjene (Fan et al. 2018). Kështu, me përjashtim të qelizave T të modifikuara nga CRISPR, TCR-të janë një mijë herë më të ndjeshme ndaj antigjeneve tumorale sesa qelizat T normale të transdukuara nga TCR. Përveç kësaj, në leuçemi të ndryshme, qelizat T të modifikuara të gjeneruara nga γδ TCR+ CRISPR shfaqin shprehje më të lartë të qelizave T CD4+ dhe CD8+ sesa transferimi standard i TCR (Legut et al., 2018). Kështu, qelizat T të modifikuara të gjeneruara nga CRISPR/Cas9 mund të jenë një metodë efektive e imunoterapisë për të kapërcyer TNBC-në.
Integrinat janë molekula të aderimit qelizor që janë të pranishme në transmembranat qelizore dhe nxisin lidhjen e qelizave me matricën jashtëqelizore (ECM) (Hamidi dhe Ivaska, 2018). Çrregullimi i integrinave shoqërohet me zhvillimin dhe migrimin e kancerit duke ndryshuar matricën jashtëqelizore, duke çuar në mbijetesën e qelizave kancerogjene në qarkullim (Hamidi dhe Ivaska, 2018). Rënia e integrinës e ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9 ngadalëson përparimin e tumorit, metastazën dhe kolonizimin në TNBC. Rënia e integrinës a5 (ITGA5) është raportuar të zvogëlojë migrimin e qelizave dhe përparimin në kancere të tjera siç është kanceri i mushkërive (Ju et al., 2017), duke sugjeruar që integrina a5 mund të jetë gjithashtu një faktor kyç në patogjenezën e TNBC.
Gjenerimi i minjve të zhdukur duke përdorur metodat tradicionale të qelizave burimore embrionale (ES) është një proces që kërkon shumë punë, kohë dhe joefikas. Duhen muaj dhe vite për të synuar qelizat ES përmes rekombinimit homolog, për të çiftëzuar minjtë kimerikë dhe më pas për t'i kryqëzuar ata me minj heterozigotë për të prodhuar pasardhës homozigotë. Kryqëzimi kompleks është i nevojshëm për të krijuar minj me mutacione të shumëfishta gjenetike. Megjithatë, kanë lindur shumë probleme kur përdoren minj të gjeneruar nga ablacioni i qelizave ES duke përdorur CRISPR/Cas9 ose duke mikroinjektuar komponentët CRISPR/Cas9 në vezë të fekonduara me një qelizë të vetme. Për shembull, futja e ndryshimeve shpesh ndodh në lokuset bialelike dhe nuk është specifike për gjenet. Kohët e fundit është raportuar se qelizat ES që përdorin teknologjinë CRISPR/Cas9 mund të futin njëkohësisht mutacione bialelike në deri në 5 gjene (Nishizono et al., 2021). Për këtë qëllim, ARNi Cas9 dhe pesë ARNi g specifike për gjenet u transfektuan njëkohësisht në qelizat ES. Kjo thekson premtimin dhe efektivitetin e kësaj procedure, megjithëse këto mutacione mund të jenë transmetuar kur linjat themeluese u kryqëzuan për të prodhuar minj pesëfish të eliminuar. Studimi raporton gjithashtu një zbulim të habitshëm: qelizat ES nuk kërkohen më për të krijuar minj të modifikuar gjenetikisht. Në vend të kësaj, për të hequr produkte specifike të gjeneve, ARNi dhe ARNi Cas9 u injektuan në embrione në fazën e një qelize të vetme. Si rezultat, janë krijuar linja themeluese eliminuese që teorikisht mund të përdoren për të studiuar pasojat e fshirjes së gjeneve tek minjtë (Qin et al., 2016). Kështu, CRISPR/Cas9 lejon krijimin e minjve transgjenikë për të trajtuar TNBC me një kosto më të ulët se inxhinieria gjenetike tradicionale. Duke përdorur sistemin CRISPR/Cas, është zhvilluar një model i ri i miut eliminues që mund të fusë me sukses mutacione pikësore në një ose më shumë gjene endogjene në TNBC. Bazuar në këtë koncept, modelet shtazore të TNBC mund të zhvillohen gjithashtu duke përdorur fshirjen e BRCA1 dhe p53 të ndërmjetësuar nga CRISPR/Cas9, duke rezultuar në humbjen e riparimit të HR, paqëndrueshmërinë gjenomike dhe fenotipet mutante (Annunziato et al., 2020).
Aktualisht, për të diagnostikuar TNBC përdoren metoda të ndryshme si mamografia, imazheria me rezonancë magnetike (MRI) dhe ultratingulli. Megjithatë, këto metoda kanë disa kufizime. Mamografia përdoret për të diagnostikuar indin lokal të gjirit në vend të metastazave, ku qelizat kancerogjene kanë migruar në organe të tjera. Ultrasonografia nuk është një metodë e besueshme për diagnostikimin e TNBC (Chen dhe Lee-Felker, 2023). MRI ka ndjeshmëri më të lartë se ultratingulli dhe mamografia, por saktësia e saj diagnostikuese është e kufizuar (Sha dhe Chen, 2022). Biopsia e indeve është një mënyrë invazive për të identifikuar qelizat kancerogjene. Megjithatë, në disa raste, një biopsi mund të humbasë indin kanceroz nëse gjilpëra largohet nga zona e interesit. Përveç kësaj, është shumë e shtrenjtë dhe mund të jetë traumatike për pacientin. TNBC është një lloj heterogjen i kancerit, kështu që një biopsi mund të mos ofrojë informacion të mjaftueshëm në lidhje me llojin e kancerit. Prandaj, nevojitet urgjentisht një metodë e re diagnostikisht e besueshme për zbulimin e TNBC. CRISPR/Cas9 mund të shërbejë si një alternativë shumë e ndjeshme dhe minimalisht invazive për diagnostikimin e kancerit të gjirit. Për këtë qëllim, strategjitë e bazuara në CRISPR/Cas9 mund të përdoren për të përmirësuar metodat PCR për diagnostikimin e TNBC. Së pari, proteinat Cas9 dhe cpf1 të sistemit CRISPR përdoren për të hequr ADN-në jo-specifike, dhe më pas këto dy proteina (Cas9 dhe cpf1) mund ta njohin sekuencën PAM para se të lidhen me ADN-në e synuar (Deepak Singh et al., 2021). Kështu, PCR mund të identifikojë mutacionet e shoqëruara me zhvillimin e kancerit. Disa studime kanë miratuar këtë strategji të bazuar në CRISPR për të zbuluar mutacione të ndryshme në kancere të ndryshme (Safari et al., 2019). Kështu, metodat PCR të bazuara në CRISPR mund të zvogëlojnë varësinë e diagnozës së TNBC nga metodat invazive siç është imunohistokimia e bazuar në biopsi.
Ndryshime gjenotipike në rregullimin e receptorëve të hormoneve janë demonstruar gjithashtu në TNBC (Chen dhe Russo, 2009). Strategjitë PCR të bazuara në CRISPR/Cas9 duke përdorur mikrovargje për diagnostikimin në pikat e kujdesit mund të monitorojnë në mënyrë efektive këto mutacione (Hajian et al., 2019). Ato gjithashtu mund t'u ofrojnë ofruesve të kujdesit shëndetësor informacione relevante në lidhje me mutacionet specifike në pacientët me TNBC, të cilat mund të ndihmojnë në përmirësimin e rrjedhës së trajtimit të tyre. Megjithatë, kjo teknikë e kombinuar ka kufizime. Prandaj, kërkohen përpjekje të gjera kërkimore përpara se kjo metodë CRISPR/Cas-PCR të mund të përdoret në kujdesin shëndetësor për diagnostikimin e TNBC (Yang et al., 2019).