Diagnoza diferenciale e nyjeve pulmonare të identifikuara nga tomografia e kompjuterizuar (CT) mbetet një sfidë në praktikën klinike.Këtu, ne karakterizojmë metabolomën globale të 480 mostrave të serumit, duke përfshirë kontrollet e shëndetshme, nyjet beninje të mushkërive dhe adenokarcinoma e mushkërive në fazën I.Adenokarcinomat shfaqin profile unike metabolike, ndërsa nyjet beninje dhe individët e shëndetshëm kanë ngjashmëri të lartë në profilet metabolike.Në grupin e zbulimit (n = 306), u identifikua një grup prej 27 metabolitësh për të dalluar nyjet beninje dhe malinje.AUC e modelit diskriminues në grupet e vlefshmërisë së brendshme (n = 104) dhe vlefshmërisë së jashtme (n = 111) ishte përkatësisht 0.915 dhe 0.945.Analiza e rrugës zbuloi rritje të metabolitëve glikolitikë të lidhur me uljen e triptofanit në serumin e adenokarcinomës së mushkërive në krahasim me nyjet beninje dhe kontrollet e shëndetshme, dhe sugjeroi që marrja e triptofanit nxit glikolizën në qelizat e kancerit të mushkërive.Studimi ynë nxjerr në pah vlerën e biomarkerëve të metabolitit të serumit në vlerësimin e rrezikut të nyjeve pulmonare të zbuluara nga CT.
Diagnoza e hershme është kritike për të përmirësuar normat e mbijetesës për pacientët me kancer.Rezultatet nga Prova Kombëtare e Shqyrtimit të Kancerit të Mushkërive në SHBA (NLST) dhe Studimi Evropian NELSON kanë treguar se ekzaminimi me tomografi kompjuterike me dozë të ulët (LDCT) mund të reduktojë ndjeshëm vdekshmërinë nga kanceri i mushkërive në grupet me rrezik të lartë1,2,3.Që nga përdorimi i gjerë i LDCT për shqyrtimin e kancerit të mushkërive, incidenca e gjetjeve të rastësishme radiografike të nyjeve pulmonare asimptomatike ka vazhduar të rritet 4 .Nyjet pulmonare përkufizohen si opacitete fokale deri në 3 cm në diametër 5 .Ne përballemi me vështirësi në vlerësimin e gjasave të malinjitetit dhe përballimin e numrit të madh të nyjeve pulmonare të zbuluara rastësisht në LDCT.Kufizimet e CT mund të çojnë në ekzaminime të shpeshta përcjellëse dhe rezultate false pozitive, duke çuar në ndërhyrje të panevojshme dhe mbitrajtim6.Prandaj, ekziston nevoja për të zhvilluar biomarkues të besueshëm dhe të dobishëm për të identifikuar saktë kancerin e mushkërive në fazat e hershme dhe për të dalluar shumicën e nyjeve beninje në zbulimin fillestar 7 .
Analiza gjithëpërfshirëse molekulare e gjakut (serumi, plazma, qelizat mononukleare të gjakut periferik), duke përfshirë gjenomikën, proteomikën ose metilimin e ADN-së8,9,10, ka çuar në rritje të interesit për zbulimin e biomarkerëve diagnostikues për kancerin e mushkërive.Ndërkohë, qasjet metabolomike matin produktet përfundimtare qelizore që ndikohen nga veprimet endogjene dhe ekzogjene dhe për këtë arsye aplikohen për të parashikuar fillimin dhe rezultatin e sëmundjes.Kromatografia e lëngshme-spektrometria e masës tandem (LC-MS) është një metodë e përdorur gjerësisht për studimet metabolomike për shkak të ndjeshmërisë së saj të lartë dhe gamës së madhe dinamike, e cila mund të mbulojë metabolitët me veti të ndryshme fiziko-kimike11,12,13.Megjithëse analiza globale metabolike e plazmës/serumit është përdorur për të identifikuar biomarkerët e lidhur me diagnozën e kancerit të mushkërive14,15,16,17 dhe efikasitetin e trajtimit,18 klasifikuesit e metabolitëve të serumit për të dalluar nyjet beninje dhe malinje të mushkërive mbeten për t'u studiuar shumë.- kërkime masive.
Adenokarcinoma dhe karcinoma e qelizave skuamoze janë dy nëntipet kryesore të kancerit të mushkërive me qeliza jo të vogla (NSCLC).Teste të ndryshme skriningu CT tregojnë se adenokarcinoma është lloji më i zakonshëm histologjik i kancerit të mushkërive1,19,20,21.Në këtë studim, ne përdorëm spektrometrinë masive me kromatografi të lëngshme me rezolucion të lartë me performancë të lartë (UPLC-HRMS) për të kryer analiza metabolike në gjithsej 695 mostra serumi, duke përfshirë kontrolle të shëndetshme, nyje pulmonare beninje dhe ≤3 cm të zbuluara me CT.Ekzaminimi për adenokarcinomën e mushkërive në fazën I.Ne identifikuam një panel metabolitësh të serumit që dallojnë adenokarcinomën e mushkërive nga nyjet beninje dhe kontrollet e shëndetshme.Analiza e pasurimit të rrugës zbuloi se metabolizmi jonormal i triptofanit dhe glukozës janë ndryshime të zakonshme në adenokarcinomën e mushkërive krahasuar me nyjet beninje dhe kontrollet e shëndetshme.Së fundi, ne krijuam dhe vërtetuam një klasifikues metabolik të serumit me specifikë dhe ndjeshmëri të lartë për të dalluar nyjet malinje dhe beninje pulmonare të zbuluara nga LDCT, të cilat mund të ndihmojnë në diagnostikimin diferencial të hershëm dhe vlerësimin e rrezikut.
Në studimin aktual, mostrat e serumit të përputhura me gjininë dhe moshën u mblodhën në mënyrë retrospektive nga 174 kontrolle të shëndetshme, 292 pacientë me nyje pulmonare beninje dhe 229 pacientë me adenokarcinoma të mushkërive të fazës I.Karakteristikat demografike të 695 subjekteve janë paraqitur në tabelën plotësuese 1.
Siç tregohet në figurën 1a, gjithsej 480 mostra serumi, duke përfshirë 174 kontroll të shëndetshëm (HC), 170 nyje beninje (BN) dhe 136 mostra të adenokarcinomës së mushkërive të fazës I (LA), u mblodhën në Qendrën e Kancerit Universitar Sun Yat-sen.Kohortë zbulimi për profilizimin metabolomik të pacaktuar duke përdorur kromatografi të lëngshme me performancë ultra-spektrometri masive me rezolucion të lartë (UPLC-HRMS).Siç tregohet në figurën plotësuese 1, metabolitët diferencialë midis LA dhe HC, LA dhe BN u identifikuan për të krijuar një model klasifikimi dhe për të eksploruar më tej analizën e rrugës diferenciale.104 mostra të mbledhura nga Qendra e Kancerit Universitare Sun Yat-sen dhe 111 mostra të mbledhura nga dy spitale të tjera iu nënshtruan respektimit të brendshëm dhe të jashtëm respektivisht.
një popullatë e studimit në grupin e zbulimit që iu nënshtrua analizës globale të metabolizmit të serumit duke përdorur kromatografi të lëngshme me performancë ultra-spektrometri masive me rezolucion të lartë (UPLC-HRMS).b Analiza e pjesshme diskriminuese e katrorëve më të vogël (PLS-DA) e metabolomit total të 480 mostrave të serumit nga grupi i studimit, duke përfshirë kontrollet e shëndetshme (HC, n = 174), nyjet beninje (BN, n = 170) dhe adenokarcinoma e mushkërive në fazën I (Los Anxhelos, n = 136).+ESI, mënyra e jonizimit me elektrospërkatje pozitive, -ESI, mënyra e jonizimit me elektrospërkatje negative.c–e Metabolitët me bollëk dukshëm të ndryshëm në dy grupe të dhëna (testi i rangut të nënshkruar me Wilcoxon me dy bishta, vlera p e rregulluar e shkallës së zbulimit të rremë, FDR <0,05) tregohen me të kuqe (ndryshim në palosje > 1,2) dhe blu (ndryshim në palosje < 0,83) .) treguar në grafikun e vullkanit.f Harta e nxehtësisë e grupimit hierarkik që tregon ndryshime të rëndësishme në numrin e metabolitëve të shënuar midis LA dhe BN.Të dhënat burimore ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave burimore.
Metaboloma totale e serumit prej 174 HC, 170 BN dhe 136 LA në grupin e zbulimit u analizua duke përdorur analizën UPLC-HRMS.Së pari tregojmë se mostrat e kontrollit të cilësisë (QC) grumbullohen fort në qendër të një modeli të analizës së komponentëve kryesorë të pambikëqyrur (PCA), duke konfirmuar stabilitetin e performancës së studimit aktual (Figura plotësuese 2).
Siç tregohet në analizën e pjesshme të diskriminimit të katrorëve më të vegjël (PLS-DA) në figurën 1 b, ne zbuluam se kishte dallime të qarta midis LA dhe BN, LA dhe HC në mënyrat pozitive (+ESI) dhe negative (−ESI) të jonizimit me elektrospërkatje. .i izoluar.Megjithatë, nuk u gjetën dallime të rëndësishme midis BN dhe HC në kushtet +ESI dhe -ESI.
Ne gjetëm 382 veçori diferenciale midis LA dhe HC, 231 veçori diferenciale midis LA dhe BN dhe 95 veçori diferenciale midis BN dhe HC (testi i renditjes së nënshkruar nga Wilcoxon, FDR <0.05 dhe ndryshimi i shumëfishtë >1.2 ose <0.83) (Figura .1c-e )..Majat u shënuan më tej (Të dhënat Suplementare 3) kundrejt një baze të dhënash (biblioteka mzCloud/HMDB/Chemspider) sipas vlerës m/z, kohës së mbajtjes dhe kërkimit të spektrit masiv të fragmentimit (detajet e përshkruara në seksionin Metodat) 22 .Më në fund, 33 dhe 38 metabolitë të shënuar me dallime të konsiderueshme në bollëk u identifikuan për LA kundrejt BN (Figura 1f dhe Tabela Suplementare 2) dhe LA kundrejt HC (Figura Suplementare 3 dhe Tabela Suplementare 2), respektivisht.Në të kundërt, vetëm 3 metabolitë me ndryshime domethënëse në bollëk u identifikuan në BN dhe HC (Tabela Suplementare 2), në përputhje me mbivendosjen midis BN dhe HC në PLS-DA.Këta metabolitë diferencialë mbulojnë një gamë të gjerë biokimikash (Figura plotësuese 4).Të marra së bashku, këto rezultate demonstrojnë ndryshime të rëndësishme në metabolomën e serumit që pasqyrojnë transformimin malinj të kancerit të mushkërive në fazën e hershme krahasuar me nyjet beninje të mushkërive ose subjektet e shëndetshme.Ndërkohë, ngjashmëria e metabolomit të serumit të BN dhe HC sugjeron se nyjet beninje pulmonare mund të ndajnë shumë karakteristika biologjike me individë të shëndetshëm.Duke pasur parasysh se mutacionet e gjeneve të receptorit të faktorit të rritjes epidermale (EGFR) janë të zakonshme në nëntipin 23 të adenokarcinomës së mushkërive, ne kërkuam të përcaktojmë ndikimin e mutacioneve drejtuese në metabolomën e serumit.Më pas kemi analizuar profilin e përgjithshëm metabolik të 72 rasteve me status EGFR në grupin e adenokarcinomës së mushkërive.Interesante, ne gjetëm profile të krahasueshme midis pacientëve mutant EGFR (n = 41) dhe pacientëve të tipit të egër EGFR (n = 31) në analizën PCA (Figura plotësuese 5a).Megjithatë, ne identifikuam 7 metabolitë, bollëku i të cilëve u ndryshua ndjeshëm në pacientët me mutacion EGFR krahasuar me pacientët me EGFR të tipit të egër (testi t, p <0,05 dhe ndryshimi i palosjes > 1,2 ose < 0,83) (Figura plotësuese 5b).Shumica e këtyre metabolitëve (5 nga 7) janë acilkarnitina, të cilat luajnë një rol të rëndësishëm në rrugët e oksidimit të acideve yndyrore.
Siç ilustrohet në rrjedhën e punës të paraqitur në figurën 2 a, biomarkerët për klasifikimin e nyjeve u morën duke përdorur operatorët më pak absolut të tkurrjes dhe përzgjedhjen bazuar në 33 metabolitë diferencialë të identifikuar në LA (n = 136) dhe BN (n = 170).Kombinimi më i mirë i variablave (LASSO) – modeli binar i regresionit logjistik.Për të testuar besueshmërinë e modelit është përdorur verifikimi i kryqëzuar dhjetëfish.Zgjedhja e variablave dhe rregullimi i parametrave rregullohen nga një penalitet maksimizimi i gjasave me parametrin λ24.Analiza e metabolomikës globale u krye më tej në mënyrë të pavarur në grupet e vlefshmërisë së brendshme (n = 104) dhe të jashtme (n = 111) për të testuar performancën e klasifikimit të modelit diskriminues.Si rezultat, 27 metabolitë në grupin e zbulimit u identifikuan si modeli më i mirë diskriminues me vlerën mesatare më të madhe AUC (Fig. 2b), ndër të cilët 9 kishin aktivitet të rritur dhe 18 aktivitet të ulur në LA krahasuar me BN (Fig. 2c).
Rrjedha e punës për ndërtimin e një klasifikuesi të nyjeve pulmonare, duke përfshirë zgjedhjen e panelit më të mirë të metabolitëve të serumit në grupin e zbulimit duke përdorur një model binar të regresionit logjistik nëpërmjet verifikimit të kryqëzuar dhjetëfish dhe vlerësimit të performancës parashikuese në grupet e verifikimit të brendshëm dhe të jashtëm.b Statistikat e verifikimit të kryqëzuar të modelit të regresionit LASSO për përzgjedhjen e biomarkerëve metabolikë.Numrat e dhënë më sipër përfaqësojnë numrin mesatar të biomarkerëve të zgjedhur në një λ të caktuar.Vija e kuqe me pika përfaqëson vlerën mesatare AUC në lambda përkatëse.Shiritat gri të gabimit përfaqësojnë vlerat minimale dhe maksimale të AUC.Vija me pika tregon modelin më të mirë me 27 biomarkerët e zgjedhur.AUC, zona nën kurbën e karakteristikës së funksionimit të marrësit (ROC).c Ndryshimet e palosura të 27 metabolitëve të përzgjedhur në grupin LA krahasuar me grupin BN në grupin e zbulimit.Kolona e kuqe - aktivizimi.Kolona blu është një rënie.d–f Kurbat e karakteristikës së funksionimit të marrësit (ROC) që tregojnë fuqinë e modelit diskriminues bazuar në 27 kombinime metabolitësh në grupet e zbulimit, të verifikimit të brendshëm dhe të jashtëm.Të dhënat burimore ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave burimore.
Një model parashikimi u krijua bazuar në koeficientët e ponderuar të regresionit të këtyre 27 metabolitëve (Tabela Suplementare 3).Analiza ROC e bazuar në këto 27 metabolitë dha një zonë nën vlerën e kurbës (AUC) prej 0.933, ndjeshmëria e grupit të zbulimit ishte 0.868 dhe specifika ishte 0.859 (Fig. 2d).Ndërkohë, midis 38 metabolitëve diferencialë të shënuar midis LA dhe HC, një grup prej 16 metabolitësh arritën një AUC prej 0,902 me një ndjeshmëri prej 0,801 dhe specifikë prej 0,856 në dallimin e LA nga HC (Figura plotësuese 6a-c).Gjithashtu u krahasuan vlerat AUC të bazuara në pragjet e ndryshme të ndryshimit të palosjes për metabolitët diferencialë.Ne zbuluam se modeli i klasifikimit performoi më mirë në dallimin midis LA dhe BN (HC) kur niveli i ndryshimit të palosjes ishte vendosur në 1.2 kundrejt 1.5 ose 2.0 (Figura plotësuese 7a,b).Modeli i klasifikimit, i bazuar në 27 grupe metabolitësh, u vërtetua më tej në grupet e brendshme dhe të jashtme.AUC ishte 0,915 (ndjeshmëria 0,867, specifika 0,811) për vërtetimin e brendshëm dhe 0,945 (ndjeshmëria 0,810, specifika 0,979) për vërtetimin e jashtëm (Fig. 2e, f).Për të vlerësuar efikasitetin ndërlaboratorik, 40 mostra nga grupi i jashtëm u analizuan në një laborator të jashtëm siç përshkruhet në seksionin Metodat.Saktësia e klasifikimit arriti një AUC prej 0,925 (Figura Suplementare 8).Për shkak se karcinoma e qelizave skuamoze të mushkërive (LUSC) është nëntipi i dytë më i zakonshëm i kancerit të mushkërive me qeliza jo të vogla (NSCLC) pas adenokarcinomës së mushkërive (LUAD), ne testuam gjithashtu dobinë e mundshme të vërtetuar të profileve metabolike.BN dhe 16 raste LUSC.AUC e diskriminimit midis LUSC dhe BN ishte 0.776 (Figura Suplementare 9), duke treguar aftësi më të dobët në krahasim me diskriminimin midis LUAD dhe BN.
Studimet kanë treguar se madhësia e nyjeve në imazhet e CT është e lidhur pozitivisht me gjasat e malinjitetit dhe mbetet një përcaktues kryesor i trajtimit të nyjeve25,26,27.Analiza e të dhënave nga grupi i madh i studimit të shqyrtimit NELSON tregoi se rreziku i sëmundjes malinje në subjektet me nyje <5 mm ishte madje i ngjashëm me atë në subjektet pa nyje 28 .Prandaj, madhësia minimale që kërkon monitorim të rregullt CT është 5 mm, siç rekomandohet nga British Toracic Society (BTS), dhe 6 mm, siç rekomandohet nga Shoqëria Fleischner 29 .Megjithatë, nyjet më të mëdha se 6 mm dhe pa karakteristika të dukshme beninje, të quajtur nodulë pulmonar të papërcaktuar (IPN), mbeten një sfidë kryesore në vlerësimin dhe menaxhimin në praktikën klinike30,31.Më pas ne ekzaminuam nëse madhësia e nyjës ndikoi në nënshkrimet metabolike duke përdorur mostra të bashkuara nga grupet e zbulimit dhe të verifikimit të brendshëm.Duke u ndalur në 27 biomarkues të vërtetuar, ne fillimisht krahasuam profilet PCA të metabolomeve HC dhe BN nën-6 mm.Ne zbuluam se shumica e pikave të të dhënave për HC dhe BN mbivendosen, duke demonstruar se nivelet e metabolitit në serum ishin të ngjashme në të dy grupet (Fig. 3a).Hartat e veçorive nëpër diapazon të madhësive të ndryshme mbetën të konservuara në BN dhe LA (Fig. 3b, c), ndërsa u vu re një ndarje midis nyjeve malinje dhe beninje në intervalin 6-20 mm (Fig. 3d).Kjo grup kishte një AUC prej 0.927, specifikën 0.868 dhe ndjeshmërinë 0.820 për parashikimin e malinjitetit të nyjeve me përmasa 6 deri në 20 mm (Fig. 3e, f).Rezultatet tona tregojnë se klasifikuesi mund të kapë ndryshimet metabolike të shkaktuara nga transformimi i hershëm malinj, pavarësisht nga madhësia e nyjës.
ad Krahasimi i profileve PCA midis grupeve të specifikuara bazuar në një klasifikues metabolik prej 27 metabolitësh.CC dhe BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.në LA 6–20 mm kundrejt LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm dhe LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Kurba e karakteristikës së funksionimit të marrësit (ROC) që tregon performancën diskriminuese të modelit për nyjet 6–20 mm.f Vlerat e probabilitetit janë llogaritur bazuar në modelin e regresionit logjistik për nyjet me përmasa 6-20 mm.Vija gri me pika përfaqëson vlerën e ndërprerjes optimale (0,455).Numrat e mësipërm përfaqësojnë përqindjen e rasteve të parashikuara për Los Angeles.Përdorni një test t Studentit me dy bishta.PCA, analiza e komponentit kryesor.Zona AUC nën kurbë.Të dhënat burimore ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave burimore.
Katër mostra (të moshës 44-61 vjeç) me madhësi të ngjashme të nyjeve pulmonare (7-9 mm) u zgjodhën më tej për të ilustruar performancën e modelit të propozuar të parashikimit të malinjitetit (Fig. 4a, b).Në shqyrtimin fillestar, rasti 1 paraqitet si një nyjë solide me kalcifikim, një tipar i shoqëruar me beninjitet, ndërsa rasti 2 paraqitet si një nyjë e papërcaktuar pjesërisht solide pa karakteristika të dukshme beninje.Tre raunde të skanimeve CT pasuese treguan se këto raste mbetën të qëndrueshme gjatë një periudhe 4-vjeçare dhe për këtë arsye konsideroheshin nodulë beninje (Fig. 4a).Krahasuar me vlerësimin klinik të skanimeve CT serike, analiza e metabolitit të serumit me një goditje me modelin aktual të klasifikuesit i identifikoi shpejt dhe saktë këto nyje beninje bazuar në kufizimet probabiliste (Tabela 1).Figura 4b në rastin 3 tregon një nyjë me shenja të tërheqjes pleurale, e cila më së shpeshti shoqërohet me malinje32.Rasti 4 paraqitet si një nyjë e papërcaktuar pjesërisht solide pa dëshmi të një shkaku beninj.Të gjitha këto raste u parashikuan si malinje sipas modelit klasifikues (Tabela 1).Vlerësimi i adenokarcinomës së mushkërive u demonstrua nga ekzaminimi histopatologjik pas operacionit të rezeksionit të mushkërive (Fig. 4b).Për grupin e vlefshmërisë së jashtme, klasifikuesi metabolik parashikoi me saktësi dy raste të nyjeve të pacaktuara të mushkërive më të mëdha se 6 mm (Figura plotësuese 10).
Pamjet CT të dritares aksiale të mushkërive të dy rasteve të noduseve beninje.Në rastin 1, skanimi CT pas 4 vitesh tregoi një nyjë solide të qëndrueshme me përmasa 7 mm me kalcifikim në lobin e poshtëm të djathtë.Në rastin 2, skanimi CT pas 5 vitesh zbuloi një nyjë të qëndrueshme, pjesërisht solide me diametër 7 mm në lobin e sipërm të djathtë.b Imazhet CT të dritares boshtore të mushkërive dhe studimet përkatëse patologjike të dy rasteve të adenokarcinomës së fazës I përpara resekcionit të mushkërive.Rasti 3 zbuloi një nyjë me diametër 8 mm në lobin e sipërm të djathtë me tërheqje pleurale.Rasti 4 zbuloi një nyjë pjesërisht të ngurtë prej xhami të bluar me përmasa 9 mm në lobin e sipërm të majtë.Ngjyrosja e hematoksilinës dhe eozinës (H&E) e indit të mushkërive të resektuar (shiriti i shkallës = 50 μm) që demonstron modelin e rritjes acinare të adenokarcinomës së mushkërive.Shigjetat tregojnë nyjet e zbuluara në imazhet CT.Imazhet H&E janë imazhe përfaqësuese të fushave të shumta (> 3) mikroskopike të ekzaminuara nga patologu.
Të marra së bashku, rezultatet tona demonstrojnë vlerën e mundshme të biomarkerëve të metabolitit të serumit në diagnozën diferenciale të nyjeve pulmonare, të cilat mund të paraqesin sfida gjatë vlerësimit të ekzaminimit CT.
Bazuar në një panel metabolit diferencial të vlefshëm, ne kërkuam të identifikonim korrelacionet biologjike të ndryshimeve të mëdha metabolike.Analiza e pasurimit të rrugës KEGG nga MetaboAnalyst identifikoi 6 rrugë të zakonshme të ndryshuara dukshëm midis dy grupeve të dhëna (LA kundrejt HC dhe LA kundrejt BN, e rregulluar p ≤ 0,001, efekti > 0,01).Këto ndryshime u karakterizuan nga shqetësime në metabolizmin e piruvateve, metabolizmin e triptofanit, metabolizmin e niacinës dhe nikotinamidit, glikolizën, ciklin TCA dhe metabolizmin e purinës (Fig. 5a).Më pas ne kryem më tej metabolomikë të synuar për të verifikuar ndryshimet kryesore duke përdorur kuantifikimin absolut.Përcaktimi i metabolitëve të zakonshëm në rrugët e ndryshuara zakonisht nga spektrometria e masës katërpolëshe (QQQ) duke përdorur standarde autentike të metabolitëve.Karakteristikat demografike të kampionit të synuar të studimit metabolomikë janë përfshirë në Tabelën Suplementare 4. Në përputhje me rezultatet tona globale të metabolizmit, analiza sasiore konfirmoi se hipoksantina dhe ksantina, piruvati dhe laktat u rritën në LA në krahasim me BN dhe HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Megjithatë, nuk u gjetën dallime të rëndësishme në këto metabolite midis BN dhe HC.
Analiza e pasurimit të rrugës KEGG të metabolitëve dukshëm të ndryshëm në grupin LA krahasuar me grupet BN dhe HC.U përdor një Globaltest me dy bisht dhe vlerat p u rregulluan duke përdorur metodën Holm-Bonferroni (rregulluar p ≤ 0,001 dhe madhësia e efektit > 0,01).b–d Grafikët e violinës që tregojnë nivelet e hipoksantinës, ksantinës, laktatit, piruvatit dhe triptofanit në serumin e HC, BN dhe LA të përcaktuara nga LC-MS/MS (n = 70 për grup).Vijat me pika të bardha dhe të zeza tregojnë përkatësisht mesataren dhe kuartilin.e Grafiku i violinës që tregon shprehjen e normalizuar të Log2TPM (transkriptet për milion) të mRNA të SLC7A5 dhe QPRT në adenokarcinomën e mushkërive (n = 513) krahasuar me indin normal të mushkërive (n = 59) në grupin e të dhënave LUAD-TCGA.Kutia e bardhë përfaqëson diapazonin ndërkuartilor, vija e zezë horizontale në qendër përfaqëson mesataren dhe vija e zezë vertikale që shtrihet nga kutia përfaqëson intervalin e besimit 95% (CI).f Grafiku i korrelacionit Pearson i shprehjes SLC7A5 dhe GAPDH në adenokarcinomën e mushkërive (n = 513) dhe indin normal të mushkërive (n = 59) në grupin e të dhënave TCGA.Zona gri përfaqëson 95% CI.r, koeficienti i korrelacionit Pearson.g Nivelet e triptofanit qelizor të normalizuara në qelizat A549 të transfektuara me kontroll jospecifik shRNA (NC) dhe shSLC7A5 (Sh1, Sh2) të përcaktuara nga LC-MS/MS.Është paraqitur analiza statistikore e pesë mostrave biologjikisht të pavarura në secilin grup.h Nivelet qelizore të NADt (gjithsej NAD, duke përfshirë NAD+ dhe NADH) në qelizat A549 (NC) dhe SLC7A5 rrëzojnë qelizat A549 (Sh1, Sh2).Është paraqitur analiza statistikore e tre mostrave biologjikisht të pavarura në secilin grup.i Aktiviteti glikolitik i qelizave A549 para dhe pas goditjes së SLC7A5 u mat me shkallën e acidifikimit jashtëqelizor (ECAR) (n = 4 mostra biologjikisht të pavarura për grup).2-DG,2-deoksi-D-glukozë.Në (b–h) u përdor testi i Studentit me dy bisht.Në (g–i), shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± SD, çdo eksperiment u krye tre herë në mënyrë të pavarur dhe rezultatet ishin të ngjashme.Të dhënat burimore ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave burimore.
Duke marrë parasysh ndikimin e rëndësishëm të ndryshimit të metabolizmit të triptofanit në grupin LA, ne vlerësuam gjithashtu nivelet e serumit të triptofanit në grupet HC, BN dhe LA duke përdorur QQQ.Ne zbuluam se triptofani i serumit ishte i reduktuar në LA krahasuar me HC ose BN (p <0.001, Figura 5d), që është në përputhje me gjetjet e mëparshme se nivelet qarkulluese të triptofanit janë më të ulëta në pacientët me kancer të mushkërive sesa në kontrollet e shëndetshme nga grupi i kontrollit33,34 ,35.Një studim tjetër duke përdorur gjurmuesin PET/CT 11C-metil-L-triptofan zbuloi se koha e mbajtjes së sinjalit të triptofanit në indet e kancerit të mushkërive ishte rritur ndjeshëm në krahasim me lezionet beninje ose indet normale36.Ne supozojmë se ulja e triptofanit në serumin LA mund të pasqyrojë marrjen aktive të triptofanit nga qelizat e kancerit të mushkërive.
Dihet gjithashtu se produkti përfundimtar i rrugës kinurenine të katabolizmit të triptofanit është NAD+37,38, i cili është një substrat i rëndësishëm për reaksionin e gliceraldehid-3-fosfatit me 1,3-bisfosfogliceratin në glikolizë39.Ndërsa studimet e mëparshme janë fokusuar në rolin e katabolizmit të triptofanit në rregullimin imunitar, ne kërkuam të sqarojmë ndërveprimin midis disrregullimit të triptofanit dhe rrugëve glikolitike të vëzhguara në studimin aktual.Familja e transportuesit të tretësirës 7 anëtarë 5 (SLC7A5) njihet si një transportues i triptofanit43,44,45.Fosforiboziltransferaza e acidit kinolinik (QPRT) është një enzimë e vendosur në rrjedhën e poshtme të rrugës së kynureninës që konverton acidin kinolinik në NAMN46.Inspektimi i grupit të të dhënave LUAD TCGA zbuloi se si SLC7A5 ashtu edhe QPRT u rregulluan ndjeshëm në indet tumorale në krahasim me indin normal (Fig. 5e).Kjo rritje u vu re në fazat I dhe II, si dhe në fazat III dhe IV të adenokarcinomës së mushkërive (Figura Suplementare 11), duke treguar shqetësime të hershme në metabolizmin e triptofanit të lidhur me tumorigjenezën.
Për më tepër, grupi i të dhënave LUAD-TCGA tregoi një korrelacion pozitiv midis shprehjes së mRNA SLC7A5 dhe GAPDH në mostrat e pacientëve me kancer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f).Në të kundërt, nuk u gjet asnjë korrelacion domethënës midis nënshkrimeve të gjeneve të tilla në indet normale të mushkërive (r = 0.25, p = 0.06, Figura 5f).Shkatërrimi i SLC7A5 (Figura Suplementare 12) në qelizat A549 uli ndjeshëm nivelet e triptofanit qelizor dhe NAD(H) (Figura 5g, h), duke rezultuar në aktivitet glikolitik të zbutur siç matet me shkallën e acidifikimit jashtëqelizor (ECAR) (Figura 1).5i).Kështu, bazuar në ndryshimet metabolike në serum dhe zbulimin in vitro, ne supozojmë se metabolizmi i triptofanit mund të prodhojë NAD+ përmes rrugës së kynureninës dhe të luajë një rol të rëndësishëm në nxitjen e glikolizës në kancerin e mushkërive.
Studimet kanë treguar se një numër i madh nyjesh pulmonare të papërcaktuara të zbuluara nga LDCT mund të çojnë në nevojën për testime shtesë si PET-CT, biopsi të mushkërive dhe mbitrajtim për shkak të një diagnoze të rreme pozitive të malinjitetit.31 Siç tregohet në figurën 6. studimi ynë identifikoi një panel metabolitësh të serumit me vlerë të mundshme diagnostike që mund të përmirësojë shtresimin e rrezikut dhe menaxhimin e mëvonshëm të nyjeve pulmonare të zbuluara nga CT.
Nodulet pulmonare vlerësohen duke përdorur tomografinë e kompjuterizuar me dozë të ulët (LDCT) me karakteristika imazherike që sugjerojnë shkaqe beninje ose malinje.Rezultati i pasigurt i nyjeve mund të çojë në vizita të shpeshta pasuese, ndërhyrje të panevojshme dhe mbitrajtim.Përfshirja e klasifikuesve metabolikë në serum me vlerë diagnostike mund të përmirësojë vlerësimin e rrezikut dhe menaxhimin e mëvonshëm të nyjeve pulmonare.Tomografia e emetimit të pozitronit PET.
Të dhënat nga studimi NLST në SHBA dhe studimi evropian NELSON sugjerojnë se shqyrtimi i grupeve me rrezik të lartë me tomografi kompjuterike me dozë të ulët (LDCT) mund të zvogëlojë vdekshmërinë nga kanceri i mushkërive1,3.Megjithatë, vlerësimi i rrezikut dhe menaxhimi klinik pasues i një numri të madh nyjesh pulmonare të rastësishme të zbuluara nga LDCT mbeten më sfiduesit.Qëllimi kryesor është të optimizohet klasifikimi i saktë i protokolleve ekzistuese të bazuara në LDCT duke përfshirë biomarkues të besueshëm.
Disa biomarkues molekularë, si metabolitët e gjakut, janë identifikuar duke krahasuar kancerin e mushkërive me kontrollet e shëndetshme15,17.Në studimin aktual, ne u fokusuam në aplikimin e analizës metabolomike të serumit për të dalluar midis nyjeve pulmonare beninje dhe malinje të zbuluar rastësisht nga LDCT.Ne krahasuam metabolomën globale të serumit të kontrollit të shëndetshëm (HC), nyjet beninje të mushkërive (BN) dhe mostrat e adenokarcinomës së mushkërive të fazës I (LA) duke përdorur analizën UPLC-HRMS.Ne zbuluam se HC dhe BN kishin profile të ngjashme metabolike, ndërsa LA tregoi ndryshime të rëndësishme në krahasim me HC dhe BN.Ne identifikuam dy grupe të metabolitëve të serumit që dallojnë LA nga HC dhe BN.
Skema aktuale e identifikimit e bazuar në LDCT për noduset beninje dhe malinje bazohet kryesisht në madhësinë, densitetin, morfologjinë dhe shkallën e rritjes së nyjeve me kalimin e kohës30.Studimet e mëparshme kanë treguar se madhësia e nyjeve është e lidhur ngushtë me gjasat e kancerit të mushkërive.Edhe në pacientët me rrezik të lartë, rreziku i malinjitetit në nyjet <6 mm është <1%.Rreziku i malinjitetit për noduset me përmasa 6 deri në 20 mm varion nga 8% në 64%30.Prandaj, Shoqëria Fleischner rekomandon një diametër prerës prej 6 mm për ndjekjen rutinë të CT.29 Megjithatë, vlerësimi i rrezikut dhe menaxhimi i nyjeve pulmonare të papërcaktuara (IPN) më të mëdha se 6 mm nuk janë kryer në mënyrë adekuate 31 .Menaxhimi aktual i sëmundjeve kongjenitale të zemrës zakonisht bazohet në pritjen vigjilente me monitorim të shpeshtë të CT.
Bazuar në metabolomën e vërtetuar, ne demonstruam për herë të parë mbivendosjen e nënshkrimeve metabolike midis individëve të shëndetshëm dhe nyjeve beninje <6 mm.Ngjashmëria biologjike është në përputhje me gjetjet e mëparshme të CT se rreziku i malinjitetit për noduset <6 mm është po aq i ulët sa për subjektet pa nyje.30 Duhet të theksohet se rezultatet tona tregojnë gjithashtu se nyjet beninje <6 mm dhe ≥6 mm kanë të lartë ngjashmëria në profilet metabolike, duke sugjeruar se përkufizimi funksional i etiologjisë beninje është i qëndrueshëm pavarësisht nga madhësia e nodulit.Kështu, panelet moderne të metabolitit të serumit diagnostikues mund të ofrojnë një analizë të vetme si një test përjashtimi kur nyjet zbulohen fillimisht në CT dhe potencialisht reduktojnë monitorimin serik.Në të njëjtën kohë, i njëjti panel i biomarkerëve metabolikë dalloi nyjet malinje me madhësi ≥6 mm nga nyjet beninje dhe siguroi parashikime të sakta për IPN me madhësi të ngjashme dhe karakteristika morfologjike të paqarta në imazhet CT.Ky klasifikues i metabolizmit të serumit performoi mirë në parashikimin e malinjitetit të nyjeve ≥6 mm me një AUC prej 0,927.Të marra së bashku, rezultatet tona tregojnë se nënshkrimet unike metabolike të serumit mund të pasqyrojnë në mënyrë specifike ndryshimet metabolike të hershme të shkaktuara nga tumori dhe të kenë vlerë potenciale si parashikues të rrezikut, pavarësisht nga madhësia e nodulit.
Veçanërisht, adenokarcinoma e mushkërive (LUAD) dhe karcinoma e qelizave skuamoze (LUSC) janë llojet kryesore të kancerit të mushkërive me qeliza jo të vogla (NSCLC).Duke pasur parasysh se LUSC është i lidhur fort me përdorimin e duhanit47 dhe LUAD është histologjia më e zakonshme e nyjeve të mushkërive të rastësishme të zbuluara në ekzaminimin CT48, modeli ynë klasifikues është ndërtuar posaçërisht për mostrat e adenokarcinomës së fazës I.Wang dhe kolegët u fokusuan gjithashtu në LUAD dhe identifikuan nëntë nënshkrime lipidike duke përdorur lipidomikë për të dalluar kancerin e mushkërive në fazën e hershme nga individët e shëndetshëm17.Ne testuam modelin aktual të klasifikuesit në 16 raste të LUSC të fazës I dhe 74 nyje beninje dhe vëzhguam saktësi të ulët të parashikimit LUSC (AUC 0.776), duke sugjeruar që LUAD dhe LUSC mund të kenë nënshkrimet e tyre metabolike.Në të vërtetë, LUAD dhe LUSC janë treguar të ndryshojnë në etiologji, origjinë biologjike dhe devijime gjenetike49.Prandaj, llojet e tjera të histologjisë duhet të përfshihen në modelet e trajnimit për zbulimin e bazuar në popullatë të kancerit të mushkërive në programet e shqyrtimit.
Këtu, ne identifikuam gjashtë rrugët më të shpeshta të ndryshuara në adenokarcinomën e mushkërive krahasuar me kontrollet e shëndetshme dhe nyjet beninje.Ksantina dhe hipoksantina janë metabolitë të zakonshëm të rrugës metabolike të purinës.Në përputhje me rezultatet tona, ndërmjetësimet e lidhura me metabolizmin e purinës u rritën ndjeshëm në serumin ose indet e pacientëve me adenokarcinoma të mushkërive krahasuar me kontrollet e shëndetshme ose pacientët në fazën parainvazive15,50.Nivelet e ngritura të ksantinës dhe hipoksantinës në serum mund të pasqyrojnë anabolizmin e kërkuar nga qelizat kancerogjene që rriten me shpejtësi.Çrregullimi i metabolizmit të glukozës është një shenjë dalluese e njohur e metabolizmit të kancerit51.Këtu, ne kemi vërejtur një rritje të konsiderueshme të piruvatit dhe laktatit në grupin LA krahasuar me grupin HC dhe BN, që është në përputhje me raportet e mëparshme të anomalive të rrugës glikolitike në profilet e metabolomit serum të pacientëve me kancer të mushkërive me qeliza jo të vogla (NSCLC) dhe kontrolle të shëndetshme.rezultatet janë konsistente52,53.
E rëndësishmja, ne vëzhguam një korrelacion të anasjelltë midis metabolizmit të piruvatit dhe triptofanit në serumin e adenokarcinomave të mushkërive.Nivelet e serumit të triptofanit u reduktuan në grupin LA krahasuar me grupin HC ose BN.Është interesante se një studim i mëparshëm në shkallë të gjerë duke përdorur një grup prospektiv zbuloi se nivelet e ulëta të triptofanit qarkullues ishin të lidhura me një rrezik në rritje të kancerit të mushkërive 54 .Triptofani është një aminoacid thelbësor që e marrim tërësisht nga ushqimi.Ne konkludojmë se zvogëlimi i triptofanit në serum në adenokarcinomën e mushkërive mund të pasqyrojë shterimin e shpejtë të këtij metaboliti.Dihet mirë se produkti përfundimtar i katabolizmit të triptofanit nëpërmjet rrugës së kynureninës është burimi i sintezës de novo NAD+.Për shkak se NAD+ prodhohet kryesisht përmes rrugës së shpëtimit, rëndësia e NAD+ në metabolizmin e triptofanit në shëndet dhe sëmundje mbetet për t'u përcaktuar46.Analiza jonë e bazës së të dhënave TCGA tregoi se shprehja e transportuesit të tretësirës së transportuesit të triptofanit 7A5 (SLC7A5) ishte rritur ndjeshëm në adenokarcinomën e mushkërive krahasuar me kontrollet normale dhe ishte në korrelacion pozitiv me shprehjen e enzimës glikolitike GAPDH.Studimet e mëparshme janë fokusuar kryesisht në rolin e katabolizmit të triptofanit në shtypjen e përgjigjes imune antitumorale40,41,42.Këtu ne demonstrojmë se frenimi i marrjes së triptofanit nga rrëzimi i SLC7A5 në qelizat e kancerit të mushkërive rezulton në një ulje të mëvonshme të niveleve qelizore të NAD dhe një zbutje shoqëruese të aktivitetit glikolitik.Në përmbledhje, studimi ynë ofron një bazë biologjike për ndryshimet në metabolizmin e serumit të shoqëruar me transformimin malinj të adenokarcinomës së mushkërive.
Mutacionet EGFR janë mutacionet më të zakonshme nxitëse në pacientët me NSCLC.Në studimin tonë, ne zbuluam se pacientët me mutacion EGFR (n = 41) kishin profile të përgjithshme metabolike të ngjashme me pacientët me EGFR të tipit të egër (n = 31), megjithëse gjetëm ulje të niveleve serike të disa pacientëve mutant EGFR në pacientët me acilkarnitinë.Funksioni i vendosur i acilkarnitinave është të transportojë grupet acil nga citoplazma në matricën mitokondriale, duke çuar në oksidimin e acideve yndyrore për të prodhuar energji 55 .Në përputhje me gjetjet tona, një studim i kohëve të fundit identifikoi gjithashtu profile të ngjashme të metabolizmit midis tumoreve mutant EGFR dhe EGFR të tipit të egër duke analizuar metabolomën globale të 102 mostrave të indit të adenokarcinomës së mushkërive50.Është interesante se përmbajtja e acilkarnitinës u gjet gjithashtu në grupin mutant EGFR.Prandaj, nëse ndryshimet në nivelet e acilkarnitinës reflektojnë ndryshime metabolike të shkaktuara nga EGFR dhe rrugët themelore molekulare mund të meritojnë studime të mëtejshme.
Si përfundim, studimi ynë vendos një klasifikues metabolik të serumit për diagnozën diferenciale të nyjeve pulmonare dhe propozon një rrjedhë pune që mund të optimizojë vlerësimin e rrezikut dhe të lehtësojë menaxhimin klinik bazuar në skanimin e CT.
Ky studim u miratua nga Komiteti i Etikës i Spitalit Universitar të Kancerit Sun Yat-sen, Spitali i Parë i lidhur i Universitetit Sun Yat-sen dhe Komiteti i Etikës i Spitalit Universitar të Kancerit Zhengzhou.Në grupet e zbulimit dhe të verifikimit të brendshëm, 174 serume nga individë të shëndetshëm dhe 244 serume nga nyje beninje u mblodhën nga individë që i nënshtroheshin ekzaminimeve mjekësore vjetore në Departamentin e Kontrollit dhe Parandalimit të Kancerit, Qendrës së Kancerit Universitar Sun Yat-sen dhe 166 nyje beninje.serum.Adenokarcinomat e mushkërive të fazës I u mblodhën nga Qendra e Kancerit Universitare Sun Yat-sen.Në grupin e vlefshmërisë së jashtme, kishte 48 raste të nyjeve beninje, 39 raste të adenokarcinomës së mushkërive të fazës I nga Spitali i Parë i Bashkuar i Universitetit Sun Yat-sen dhe 24 raste të adenokarcinomës së mushkërive të fazës I nga Spitali i Kancerit Zhengzhou.Qendra e Kancerit Universitare Sun Yat-sen mblodhi gjithashtu 16 raste të kancerit të mushkërive me qeliza skuamoze të fazës I për të testuar aftësinë diagnostike të klasifikuesit metabolik të vendosur (karakteristikat e pacientit tregohen në Tabelën Suplementare 5).Mostrat nga grupi i zbulimit dhe grupi i vlefshmërisë së brendshme u mblodhën midis janarit 2018 dhe majit 2020. Mostrat për grupin e verifikimit të jashtëm u mblodhën midis gushtit 2021 dhe tetorit 2022. Për të minimizuar paragjykimet gjinore, secilit iu caktua numër afërsisht i barabartë i rasteve meshkuj dhe femra grup.Ekipi i zbulimit dhe ekipi i rishikimit të brendshëm.Gjinia e pjesëmarrësit u përcaktua në bazë të vetë-raportimit.Është marrë pëlqimi i informuar nga të gjithë pjesëmarrësit dhe nuk është dhënë asnjë kompensim.Subjektet me nyje beninje ishin ata me një rezultat të qëndrueshëm të skanimit CT në 2 deri në 5 vjet në momentin e analizës, me përjashtim të 1 rasti nga kampioni i vërtetimit të jashtëm, i cili u mblodh para operacionit dhe u diagnostikua me histopatologji.Me përjashtim të bronkitit kronik.Rastet e adenokarcinomës së mushkërive janë mbledhur para resekcionit të mushkërive dhe janë konfirmuar me diagnozë patologjike.Mostrat e gjakut të agjërimit u mblodhën në tubat e ndarjes së serumit pa asnjë antikoagulant.Mostrat e gjakut u mpiksën për 1 orë në temperaturën e dhomës dhe më pas u centrifuguan në 2851 × g për 10 minuta në 4°C për të mbledhur supernatantin e serumit.Pjesët e serumit u ngrinë në -80°C deri në nxjerrjen e metabolitit.Departamenti i Parandalimit të Kancerit dhe Ekzaminimit Mjekësor i Qendrës së Kancerit Universitar Sun Yat-sen mblodhi një grup serumi nga 100 donatorë të shëndetshëm, duke përfshirë një numër të barabartë burrash dhe grash të moshës 40 deri në 55 vjeç.Vëllime të barabarta të çdo kampioni të donatorëve u përzien, grupi që rezultoi u nda dhe u ruajt në -80°C.Përzierja e serumit u përdor si material referencë për kontrollin e cilësisë dhe standardizimin e të dhënave.
Serumi i referencës dhe mostrat e provës u shkrinë dhe metabolitët u nxorën duke përdorur një metodë të kombinuar ekstraktimi (MTBE/metanol/ujë) 56 .Shkurtimisht, 50 μl serum u përzien me 225 μl metanol të ftohtë në akull dhe 750 μl metil tert-butil eter të ftohtë në akull (MTBE).Përzieni përzierjen dhe inkuboni në akull për 1 orë.Mostrat u përzien më pas dhe u përzien me vorbull me 188 μl ujë të shkallës MS që përmban standarde të brendshme (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metioninë dhe 13C6-izoleucinë, të blera nga Laboratorët e Isotopit të Kembrixhit).Përzierja më pas u centrifugua në 15,000 × g për 10 minuta në 4 ° C dhe faza e poshtme u transferua në dy tuba (125 μL secila) për analizën LC-MS në mënyra pozitive dhe negative.Më në fund, kampioni u avullua deri në tharje në një koncentrues vakum me shpejtësi të lartë.
Metabolitët e tharë u rindërtuan në 120 μl acetonitril 80%, u rrotulluan për 5 minuta dhe u centrifuguan në 15,000 × g për 10 minuta në 4°C.Supernatantët u transferuan në shishe qelqi qelibar me mikroinserte për studime metabolike.Analizë metabolomike e pa synuar në një platformë me kromatografi të lëngshme me rezolucion të lartë (UPLC-HRMS) me performancë të lartë.Metabolitet u ndanë duke përdorur një sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC dhe një kolonë ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Në modalitetin e joneve pozitive, fazat e lëvizshme ishin 95% (A) dhe 50% acetonitril (B), secila përmbante 10 mmol/L acetat amoni dhe 0,1% acid formik.Në modalitetin negativ, fazat e lëvizshme A dhe B përmbanin përkatësisht 95% dhe 50% acetonitril, të dyja fazat përmbanin 10 mmol/L acetat amoniumi, pH = 9. Programi i gradientit ishte si më poshtë: 0–0.5 min, 2% B;0,5-12 min, 2-50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1-20 min, 2% B. Kolona u mbajt në 40°C dhe kampioni në 10°C në autosampler.Shpejtësia e rrjedhjes ishte 0.3 ml/min, vëllimi i injektimit ishte 3 μl.Një spektrometër masiv Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) me një burim jonizimi me elektrospërkatje (ESI) u përdor në modalitetin e skanimit të plotë dhe u bashkua me modalitetin e monitorimit ddMS2 për të mbledhur vëllime të mëdha të dhënash.Parametrat MS u vendosën si më poshtë: tensioni i spërkatjes +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura kapilar 320°C, gazi mbrojtës 40 arb, gazi ndihmës 10 arb, temperatura e ngrohësit të sondës 350°C, diapazoni i skanimit 70–1050 m/h, rezolucioni.70 000. Të dhënat janë marrë duke përdorur Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Për të vlerësuar cilësinë e të dhënave, mostrat e kontrollit të cilësisë së bashkuar (QC) u krijuan duke hequr 10 μL pjesë të supernatantit nga çdo mostër.Gjashtë injeksione të mostrës së kontrollit të cilësisë u analizuan në fillim të sekuencës analitike për të vlerësuar stabilitetin e sistemit UPLC-MS.Mostrat e kontrollit të cilësisë më pas futen periodikisht në grup.Të 11 grupet e mostrave të serumit në këtë studim u analizuan me LC-MS.Pjesë të një përzierjeje serumi nga 100 donatorë të shëndetshëm u përdorën si material referimi në tufat përkatëse për të monitoruar procesin e nxjerrjes dhe për të përshtatur për efektet nga grup në grup.Analiza metabolomike e pa synuar e grupit të zbulimit, grupit të verifikimit të brendshëm dhe grupit të vlefshmërisë së jashtme u krye në Qendrën Metabolomike të Universitetit Sun Yat-sen.Laboratori i jashtëm i Qendrës së Analizës dhe Testimit të Universitetit të Teknologjisë Guangdong analizoi gjithashtu 40 mostra nga grupi i jashtëm për të testuar performancën e modelit të klasifikuesit.
Pas nxjerrjes dhe rindërtimit, sasia absolute e metabolitëve të serumit u mat duke përdorur spektrometrinë masive të kromatografisë së lëngshme me performancë ultra të lartë-tandem (Agilent 6495 trefishtë katërpolësh) me një burim jonizimi me elektrospërkatje (ESI) në modalitetin e monitorimit të reagimit të shumëfishtë (MRM).Një kolonë ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) u përdor për të ndarë metabolitët.Faza e lëvizshme përbëhej nga 90% (A) dhe 5% acetonitril (B) me 10 mmol/L acetat amoni dhe 0.1% tretësirë amoniaku.Programi i gradientit ishte si më poshtë: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5-11,5 min, 0% B.Kolona u mbajt në 40 °C dhe kampioni në 10 °C në autosampler.Shpejtësia e rrjedhës ishte 0.3 mL/min dhe vëllimi i injektimit ishte 1 μL.Parametrat MS u vendosën si më poshtë: tensioni kapilar ±3,5 kV, presioni i nebulizatorit 35 psi, rrjedha e gazit të mbështjellësit 12 L/min, temperatura e gazit të këllëfit 350°C, temperatura e gazit të tharjes 250°C dhe rrjedha e gazit tharës 14 l/min.Konvertimet MRM të triptofanit, piruvatit, laktatit, hipoksantinës dhe ksantinës ishin 205.0-187.9, 87.0-43.4, 89.0-43.3, 135.0-92.3 dhe 151.0-107.9 respektivisht.Të dhënat u mblodhën duke përdorur Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Për mostrat e serumit, triptofani, piruvati, laktat, hipoksantina dhe ksantina u përcaktuan në sasi duke përdorur kurbat e kalibrimit të zgjidhjeve standarde të përzierjes.Për mostrat e qelizave, përmbajtja e triptofanit u normalizua në standardin e brendshëm dhe masën e proteinave qelizore.
Ekstraktimi i pikut (m/z dhe koha e mbajtjes (RT)) u krye duke përdorur Compound Discovery 3.1 dhe TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Për të eliminuar ndryshimet e mundshme midis grupeve, çdo kulm karakteristik i kampionit të provës u nda me majën karakteristike të materialit referues nga e njëjta grumbull për të marrë bollëkun relativ.Devijimet standarde relative të standardeve të brendshme para dhe pas standardizimit janë paraqitur në tabelën plotësuese 6. Ndryshimet midis dy grupeve u karakterizuan nga shkalla e zbulimit të rremë (FDR<0.05, testi i rangut të nënshkruar nga Wilcoxon) dhe ndryshimi i palosjes (>1.2 ose <0.83).Të dhënat e papërpunuara të MS të veçorive të nxjerra dhe të dhënat e MS të korrigjuara me serum referencë tregohen respektivisht në Të dhënat Suplementare 1 dhe Të Dhënat Suplementare 2.Shënimi maksimal u krye në bazë të katër niveleve të përcaktuara të identifikimit, duke përfshirë metabolitët e identifikuar, komponimet e supozuara me shënime, klasat e përbërjeve të karakterizuara me sa duket dhe komponimet e panjohura 22 .Bazuar në kërkimet e bazës së të dhënave në Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), komponimet biologjike me MS/MS që përputhen me standardet e vërtetuara ose shënimet e saktë të përputhjes në mzCloud (rezultati > 85) ose Chemspider më në fund u zgjodhën si ndërmjetës midis metabolomit diferencial.Shënimet maksimale për çdo veçori përfshihen në të dhënat plotësuese 3. MetaboAnalyst 5.0 u përdor për analizën e njëanshme të bollëkut të metabolitëve të normalizuar nga shuma.MetaboAnalyst 5.0 vlerësoi gjithashtu analizën e pasurimit të rrugës KEGG bazuar në metabolitë dukshëm të ndryshëm.Analiza e komponentit kryesor (PCA) dhe analiza e pjesshme diskriminuese e katrorëve më të vegjël (PLS-DA) u analizuan duke përdorur paketën e softuerit ropls (v.1.26.4) me normalizim të stivës dhe shkallëzim automatik.Modeli optimal i biomarkerit të metabolitit për parashikimin e malinjitetit të nodulit u krijua duke përdorur regresionin binar logjistik me operatorin më pak të tkurrjes absolute dhe përzgjedhjes (LASSO, paketa R v.4.1-3).Performanca e modelit diskriminues në grupet e zbulimit dhe vlefshmërisë u karakterizua nga vlerësimi i AUC bazuar në analizën ROC sipas paketës pROC (v.1.18.0.).Ndërprerja optimale e probabilitetit është marrë bazuar në indeksin maksimal Youden të modelit (ndjeshmëri + specifikë - 1).Mostrat me vlera më të vogla ose më të mëdha se pragu do të parashikohen përkatësisht si nyje beninje dhe adenokarcinoma pulmonare.
Qelizat A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) u rritën në mjedis F-12K që përmban 10% FBS.Sekuencat e shkurtra të ARN-së (shRNA) të kapëses së flokëve që synojnë SLC7A5 dhe një kontroll pa synim (NC) u futën në vektorin lentiviral pLKO.1-puro.Sekuencat antisens të shSLC7A5 janë si më poshtë: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Antitrupat ndaj SLC7A5 (#5347) dhe tubulinën (#2148) u blenë nga Cell Signaling Technology.Antitrupat ndaj SLC7A5 dhe tubulinës u përdorën në një hollim prej 1:1000 për analizën Western blot.
Testi glikolitik i stresit Seahorse XF mat nivelet e acidifikimit jashtëqelizor (ECAR).Në analizë, glukoza, oligomicina A dhe 2-DG u administruan në mënyrë sekuenciale për të testuar kapacitetin glikolitik qelizor të matur me ECAR.
Qelizat A549 të transfektuara me kontroll pa target (NC) dhe shSLC7A5 (Sh1, Sh2) u vendosën gjatë natës në enë me diametër 10 cm.Metabolitët e qelizave u nxorrën me 1 ml metanol ujor 80% të ftohtë në akull.Qelizat në tretësirën e metanolit u gërvishten, u mblodhën në një tub të ri dhe u centrifuguan në 15,000 × g për 15 minuta në 4 ° C.Mblidhni 800 µl supernatant dhe thajeni duke përdorur një koncentrues vakum me shpejtësi të lartë.Peletat e thara të metabolitit u analizuan më pas për nivelet e triptofanit duke përdorur LC-MS/MS siç përshkruhet më sipër.Nivelet qelizore të NAD(H) në qelizat A549 (NC dhe shSLC7A5) u matën duke përdorur një komplet kolorimetrik sasior NAD+/NADH (#K337, BioVision) sipas udhëzimeve të prodhuesit.Nivelet e proteinave u matën për çdo mostër për të normalizuar sasinë e metabolitëve.
Asnjë metodë statistikore nuk u përdor për të përcaktuar paraprakisht madhësinë e kampionit.Studimet e mëparshme metabolomike që synonin zbulimin e biomarkerëve15,18 janë konsideruar si pikë referimi për përcaktimin e madhësisë dhe krahasuar me këto raporte, kampioni ynë ishte adekuat.Asnjë kampion nuk u përjashtua nga grupi i studimit.Mostrat e serumit iu caktuan rastësisht një grupi zbulimi (306 raste, 74.6%) dhe një grupi të brendshëm të vlefshmërisë (104 raste, 25.4%) për studime metabolomike të pa synuara.Ne gjithashtu zgjodhëm rastësisht 70 raste nga secili grup nga grupi i zbulimeve për studimet e synuara të metabolizmit.Hetuesit u verbuan ndaj caktimit në grup gjatë mbledhjes dhe analizës së të dhënave LC-MS.Analizat statistikore të të dhënave metabolomike dhe eksperimentet e qelizave përshkruhen në seksionet përkatëse "Rezultatet", "Legjendat e figurave" dhe "Metodat".Kuantifikimi i triptofanit qelizor, NADT dhe aktivitetit glikolitik u krye tre herë në mënyrë të pavarur me rezultate identike.
Për më shumë informacion rreth dizajnit të studimit, shihni Abstraktin e Raportit të Portofolit Natyror të lidhur me këtë artikull.
Të dhënat e papërpunuara MS të veçorive të nxjerra dhe të dhënat e normalizuara të MS të serumit të referencës tregohen respektivisht në Të dhënat Suplementare 1 dhe Të Dhënat Suplementare 2.Shënimet maksimale për veçoritë diferenciale janë paraqitur në Të dhënat Suplementare 3. Të dhënat e të dhënave LUAD TCGA mund të shkarkohen nga https://portal.gdc.cancer.gov/.Të dhënat hyrëse për vizatimin e grafikut jepen në të dhënat burimore.Të dhënat burimore janë dhënë për këtë artikull.
Grupi Kombëtar i Studimit të Ekzaminimit të Mushkërive, etj. Reduktimi i vdekshmërisë nga kanceri i mushkërive me tomografi kompjuterike me dozë të ulët.Anglia Veriore.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR dhe Prophet, PC Ekzaminimi i kancerit të mushkërive duke përdorur CT spirale me dozë të ulët: rezultate nga Studimi Kombëtar i Ekzaminimit të Mushkërive (NLST).J. Med.Ekrani 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, etj.Zvogëlimi i vdekshmërisë nga kanceri i mushkërive me shqyrtimin volumetrik të CT në një provë të rastësishme.Anglia Veriore.J. Med.382, 503–513 (2020).
Koha e postimit: Shtator-18-2023