Diagnoza diferenciale e noduleve pulmonare të identifikuara nga tomografia e kompjuterizuar (CT) mbetet një sfidë në praktikën klinike. Këtu, ne karakterizojmë metabolomin global të 480 mostrave të serumit, duke përfshirë kontrollet e shëndetshme, nodulet beninje të mushkërive dhe adenokarcinomën e mushkërive në fazën I. Adenokarcinomat shfaqin profile unike metabolomike, ndërsa nodulet beninje dhe individët e shëndetshëm kanë ngjashmëri të lartë në profilet metabolomike. Në grupin e zbulimit (n = 306), u identifikua një grup prej 27 metabolitësh për të dalluar midis noduleve beninje dhe malinje. AUC e modelit dallues në grupet e validimit të brendshëm (n = 104) dhe validimit të jashtëm (n = 111) ishte përkatësisht 0.915 dhe 0.945. Analiza e rrugës zbuloi metabolitë glikolitike të rritura të shoqëruara me triptofan të ulur në serumin e adenokarcinomës së mushkërive krahasuar me nodulet beninje dhe kontrollet e shëndetshme, dhe sugjeroi që thithja e triptofanit nxit glikolizën në qelizat e kancerit të mushkërive. Studimi ynë nxjerr në pah vlerën e bioshënuesve të metabolitëve të serumit në vlerësimin e rrezikut të noduleve pulmonare të zbuluara nga CT.
Diagnoza e hershme është thelbësore për të përmirësuar shkallën e mbijetesës për pacientët me kancer. Rezultatet nga Studimi Kombëtar i SHBA-së për Depistimin e Kancerit të Mushkërive (NLST) dhe Studimi Evropian NELSON kanë treguar se depistimi me tomografi kompjuterike me dozë të ulët (LDCT) mund të zvogëlojë ndjeshëm vdekshmërinë nga kanceri i mushkërive në grupet me rrezik të lartë1,2,3. Që nga përdorimi i gjerë i LDCT për depistimin e kancerit të mushkërive, incidenca e gjetjeve radiografike rastësore të noduleve pulmonare asimptomatike ka vazhduar të rritet4. Nodulet pulmonare përcaktohen si errësira fokale deri në 3 cm në diametër5. Ne përballemi me vështirësi në vlerësimin e gjasave të malinjitetit dhe në trajtimin e numrit të madh të noduleve pulmonare të zbuluara rastësisht në LDCT. Kufizimet e CT mund të çojnë në ekzaminime të shpeshta ndjekëse dhe rezultate pozitive të rreme, duke çuar në ndërhyrje dhe trajtim të tepërt6. Prandaj, ekziston nevoja për të zhvilluar biomarkues të besueshëm dhe të dobishëm për të identifikuar saktë kancerin e mushkërive në fazat e hershme dhe për të dalluar shumicën e noduleve beninje në zbulimin fillestar7.
Analiza gjithëpërfshirëse molekulare e gjakut (serum, plazmë, qeliza mononukleare të gjakut periferik), duke përfshirë gjenomikën, proteomikën ose metilimin e ADN-së8,9,10, ka çuar në rritjen e interesit në zbulimin e biomarkuesve diagnostikues për kancerin e mushkërive. Ndërkohë, qasjet metabolomike matin produktet fundore qelizore që ndikohen nga veprimet endogjene dhe ekzogjene dhe për këtë arsye aplikohen për të parashikuar fillimin dhe rezultatin e sëmundjes. Kromatografia e lëngshme-spektrometria masive tandem (LC-MS) është një metodë e përdorur gjerësisht për studimet metabolomike për shkak të ndjeshmërisë së saj të lartë dhe diapazonit të madh dinamik, i cili mund të mbulojë metabolitët me veti të ndryshme fiziko-kimike11,12,13. Megjithëse analiza globale metabolomike e plazmës/serumit është përdorur për të identifikuar biomarkuesit e lidhur me diagnozën e kancerit të mushkërive14,15,16,17 dhe efikasitetin e trajtimit,18 klasifikuesit e metabolitëve të serumit për të dalluar midis nodulave beninje dhe malinje të mushkërive mbeten për t'u studiuar shumë. -hulumtim masiv.
Adenokarcinoma dhe karcinoma me qeliza skuamoze janë dy nëntipet kryesore të kancerit të mushkërive me qeliza jo të vogla (NSCLC). Teste të ndryshme të shqyrtimit CT tregojnë se adenokarcinoma është lloji histologjik më i zakonshëm i kancerit të mushkërive1,19,20,21. Në këtë studim, ne përdorëm kromatografi të lëngshme me performancë ultra-të lartë - spektrometri masive me rezolucion të lartë (UPLC-HRMS) për të kryer analizë metabolomike në një total prej 695 mostrash serumi, duke përfshirë kontrolle të shëndetshme, nodula pulmonare beninje dhe të zbuluara me CT ≤3 cm. Shqyrtimi për adenokarcinomën e mushkërive të Fazës I. Ne identifikuam një panel metabolitësh serumi që dallojnë adenokarcinomën e mushkërive nga nodulat beninje dhe kontrollet e shëndetshme. Analiza e pasurimit të rrugëve zbuloi se metabolizmi jonormal i triptofanit dhe glukozës janë ndryshime të zakonshme në adenokarcinomën e mushkërive krahasuar me nodulat beninje dhe kontrollet e shëndetshme. Së fundmi, ne krijuam dhe validuam një klasifikues metabolik serumi me specifikë dhe ndjeshmëri të lartë për të dalluar midis nodulave pulmonare malinje dhe beninje të zbuluara nga LDCT, të cilat mund të ndihmojnë në diagnozën diferenciale të hershme dhe vlerësimin e rrezikut.
Në studimin aktual, mostrat e serumit të përputhura sipas gjinisë dhe moshës u mblodhën në mënyrë retrospektive nga 174 kontrolle të shëndetshme, 292 pacientë me nodula beninje pulmonare dhe 229 pacientë me adenokarcinomë pulmonare në fazën I. Karakteristikat demografike të 695 subjekteve tregohen në Tabelën Plotësuese 1.
Siç tregohet në Figurën 1a, një total prej 480 mostrash serumi, duke përfshirë 174 mostra kontrolli të shëndetshëm (HC), 170 nodula beninje (BN) dhe 136 mostra të adenokarcinomës së mushkërive (LA) në fazën I, u mblodhën në Qendrën e Kancerit Universitar Sun Yat-sen. Kohorta e zbulimit për profilizimin metabolomik të pacaktuar duke përdorur kromatografi të lëngshme me performancë ultra-performuese - spektrometri masive me rezolucion të lartë (UPLC-HRMS). Siç tregohet në Figurën Plotësuese 1, metabolitët diferencialë midis LA dhe HC, LA dhe BN u identifikuan për të krijuar një model klasifikimi dhe për të eksploruar më tej analizën e rrugës diferenciale. 104 mostra të mbledhura nga Qendra e Kancerit Universitar Sun Yat-sen dhe 111 mostra të mbledhura nga dy spitale të tjera iu nënshtruan përkatësisht validimit të brendshëm dhe të jashtëm.
a Popullata e studimit në kohortën e zbulimit që iu nënshtrua analizës globale të metabolomikës së serumit duke përdorur kromatografi të lëngshme me performancë ultra-performuese - spektrometri masive me rezolucion të lartë (UPLC-HRMS). b Analiza diskriminuese e pjesshme e katrorëve më të vegjël (PLS-DA) e metabolomit total të 480 mostrave të serumit nga kohorta e studimit, duke përfshirë kontrolle të shëndetshme (HC, n = 174), nodula beninje (BN, n = 170) dhe adenokarcinomën e mushkërive në fazën I (Los Angeles, n = 136). +ESI, mënyra pozitive e jonizimit me elektrospraj, -ESI, mënyra negative e jonizimit me elektrospraj. c–e Metabolitët me bollëk dukshëm të ndryshëm në dy grupe të dhëna (testi i renditjes me shenjë Wilcoxon me dy bishta, vlera p e rregulluar nga shkalla e zbulimit të rremë, FDR <0.05) tregohen me të kuqe (ndryshimi i palimit > 1.2) dhe blu (ndryshimi i palimit < 0.83). ) tregohet në grafikun e vullkanit. f Harta e nxehtësisë së grupimit hierarkik që tregon ndryshime të rëndësishme në numrin e metabolitëve të shënuar midis LA dhe BN. Të dhënat burimore ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave burimore.
Metaboloma totale e serumit prej 174 HC, 170 BN dhe 136 LA në grupin e zbulimit u analizua duke përdorur analizën UPLC-HRMS. Ne së pari tregojmë se mostrat e kontrollit të cilësisë (QC) grumbullohen fort në qendër të një modeli të analizës së komponentëve kryesorë të pambikëqyrur (PCA), duke konfirmuar stabilitetin e performancës së studimit aktual (Figura Plotësuese 2).
Siç tregohet në analizën diskriminuese të pjesshme të katrorëve më të vegjël (PLS-DA) në Figurën 1 b, zbuluam se kishte dallime të qarta midis LA dhe BN, LA dhe HC në mënyrat pozitive (+ESI) dhe negative (-ESI) të jonizimit me elektrosprej. Megjithatë, nuk u gjetën dallime të rëndësishme midis BN dhe HC në kushtet +ESI dhe -ESI.
Ne gjetëm 382 karakteristika diferenciale midis LA dhe HC, 231 karakteristika diferenciale midis LA dhe BN, dhe 95 karakteristika diferenciale midis BN dhe HC (testi i renditjes së shënuar Wilcoxon, FDR <0.05 dhe ndryshim i shumëfishtë >1.2 ose <0.83) (Figura .1c-e). . Majat u shënuan më tej (Të dhëna plotësuese 3) kundrejt një baze të dhënash (biblioteka mzCloud/HMDB/Chemspider) sipas vlerës m/z, kohës së mbajtjes dhe kërkimit të spektrit të masës së fragmentimit (detajet e përshkruara në seksionin e Metodave) 22. Së fundmi, 33 dhe 38 metabolitë të shënjuar me ndryshime të rëndësishme në bollëk u identifikuan përkatësisht për LA kundrejt BN (Figura 1f dhe Tabela plotësuese 2) dhe LA kundrejt HC (Figura plotësuese 3 dhe Tabela plotësuese 2), në të kundërt, vetëm 3 metabolitë me ndryshime të rëndësishme në bollëk u identifikuan në BN dhe HC (Tabela plotësuese 2), në përputhje me mbivendosjen midis BN dhe HC në PLS-DA. Këto metabolitë diferencialë mbulojnë një gamë të gjerë biokimikash (Figura Plotësuese 4). Të marra së bashku, këto rezultate demonstrojnë ndryshime të rëndësishme në metabolomin e serumit që pasqyrojnë transformimin malinj të kancerit të mushkërive në fazë të hershme krahasuar me nyjet beninje të mushkërive ose subjektet e shëndetshme. Ndërkohë, ngjashmëria e metabolomit të serumit të BN dhe HC sugjeron që nyjet beninje pulmonare mund të ndajnë shumë karakteristika biologjike me individë të shëndetshëm. Duke pasur parasysh se mutacionet e gjenit të receptorit të faktorit të rritjes epidermale (EGFR) janë të zakonshme në nëntipin 23 të adenokarcinomës së mushkërive, ne kërkuam të përcaktonim ndikimin e mutacioneve nxitëse në metabolomin e serumit. Pastaj analizuam profilin e përgjithshëm metabolomik të 72 rasteve me status EGFR në grupin e adenokarcinomës së mushkërive. Është interesante se gjetëm profile të krahasueshme midis pacientëve me mutant EGFR (n = 41) dhe pacientëve të tipit të egër EGFR (n = 31) në analizën PCA (Figura Plotësuese 5a). Megjithatë, ne identifikuam 7 metabolite, sasia e të cilëve ndryshoi ndjeshëm tek pacientët me mutacion EGFR krahasuar me pacientët me EGFR të tipit të egër (testi t, p < 0.05 dhe ndryshimi i fishuar > 1.2 ose < 0.83) (Figura plotësuese 5b). Shumica e këtyre metabolitëve (5 nga 7) janë acilkarnitina, të cilat luajnë një rol të rëndësishëm në rrugët e oksidimit të acideve yndyrore.
Siç ilustrohet në rrjedhën e punës të treguar në Figurën 2a, bioshënuesit për klasifikimin e nyjeve u morën duke përdorur operatorët e tkurrjes më të vogël absolute dhe përzgjedhjen bazuar në 33 metabolitë diferencialë të identifikuar në LA (n = 136) dhe BN (n = 170). Kombinimi më i mirë i variablave (LASSO) – modeli i regresionit logjistik binar. Validimi i kryqëzuar dhjetëfish u përdor për të testuar besueshmërinë e modelit. Përzgjedhja e variablave dhe rregullimi i parametrave rregullohen nga një penalitet i maksimizimit të gjasës me parametrin λ24. Analiza globale e metabolomikës u krye më tej në mënyrë të pavarur në grupet e validimit të brendshëm (n = 104) dhe validimit të jashtëm (n = 111) për të testuar performancën e klasifikimit të modelit dallues. Si rezultat, 27 metabolitë në grupin e zbulimeve u identifikuan si modeli më i mirë dallues me vlerën mesatare më të madhe të AUC (Fig. 2b), ndër të cilët 9 kishin aktivitet të rritur dhe 18 aktivitet të ulur në LA krahasuar me BN (Fig. 2c).
Fluksi i punës për ndërtimin e një klasifikuesi të nyjave pulmonare, duke përfshirë përzgjedhjen e panelit më të mirë të metabolitëve të serumit në grupin e zbulimit duke përdorur një model regresioni logjistik binar nëpërmjet validimit të kryqëzuar dhjetëfish dhe vlerësimin e performancës parashikuese në grupet e validimit të brendshëm dhe të jashtëm. b Statistikat e validimit të kryqëzuar të modelit të regresionit LASSO për përzgjedhjen e biomarkuesve metabolikë. Numrat e dhënë më sipër përfaqësojnë numrin mesatar të biomarkuesve të zgjedhur në një λ të caktuar. Vija e kuqe me pika përfaqëson vlerën mesatare AUC në lambda përkatëse. Shiritat gri të gabimit përfaqësojnë vlerat minimale dhe maksimale të AUC. Vija me pika tregon modelin më të mirë me 27 biomarkuesit e zgjedhur. AUC, zona nën kurbën e karakteristikës operative të marrësit (ROC). c Ndryshimet e palosura të 27 metabolitëve të zgjedhur në grupin LA krahasuar me grupin BN në grupin e zbulimit. Kolona e kuqe - aktivizimi. Kolona blu është një rënie. d–f Kurbat e karakteristikës operative të marrësit (ROC) që tregojnë fuqinë e modelit dallues bazuar në 27 kombinime metabolitësh në grupet e validimit të zbulimit, të brendshëm dhe të jashtëm. Të dhënat burimore ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave burimore.
Një model parashikimi u krijua bazuar në koeficientët e regresionit të ponderuar të këtyre 27 metabolitëve (Tabela Plotësuese 3). Analiza ROC bazuar në këto 27 metabolite dha një vlerë të zonës nën kurbë (AUC) prej 0.933, ndjeshmëria e grupit të zbulimit ishte 0.868 dhe specifika ishte 0.859 (Fig. 2d). Ndërkohë, midis 38 metabolitëve diferencialë të shënuar midis LA dhe HC, një grup prej 16 metabolitësh arriti një AUC prej 0.902 me një ndjeshmëri prej 0.801 dhe specifikë prej 0.856 në dallimin e LA nga HC (Figura Plotësuese 6a-c). U krahasuan gjithashtu vlerat e AUC bazuar në pragje të ndryshme të ndryshimit të palosjes për metabolitët diferencialë. Ne zbuluam se modeli i klasifikimit performoi më mirë në dallimin midis LA dhe BN (HC) kur niveli i ndryshimit të palosjes ishte vendosur në 1.2 kundrejt 1.5 ose 2.0 (Figura Plotësuese 7a,b). Modeli i klasifikimit, bazuar në 27 grupe metabolitësh, u validua më tej në grupe të brendshme dhe të jashtme. AUC ishte 0.915 (ndjeshmëri 0.867, specifikë 0.811) për validimin e brendshëm dhe 0.945 (ndjeshmëri 0.810, specifikë 0.979) për validimin e jashtëm (Fig. 2e, f). Për të vlerësuar efikasitetin ndërlaboratorik, 40 mostra nga grupi i jashtëm u analizuan në një laborator të jashtëm siç përshkruhet në seksionin Metodat. Saktësia e klasifikimit arriti një AUC prej 0.925 (Figura Plotësuese 8). Meqenëse karcinoma me qeliza skuamoze të mushkërive (LUSC) është nëntipi i dytë më i zakonshëm i kancerit të mushkërive me qeliza jo të vogla (NSCLC) pas adenokarcinomës së mushkërive (LUAD), ne gjithashtu testuam dobinë e mundshme të validuar të profileve metabolike. BN dhe 16 raste të LUSC. AUC e dallimit midis LUSC dhe BN ishte 0.776 (Figura Plotësuese 9), duke treguar aftësi më të dobët krahasuar me dallimin midis LUAD dhe BN.
Studimet kanë treguar se madhësia e nyjeve në imazhet CT është e lidhur pozitivisht me gjasat e keqdashjes dhe mbetet një përcaktues kryesor i trajtimit të nyjeve25,26,27. Analiza e të dhënave nga grupi i madh i studimit të shqyrtimit NELSON tregoi se rreziku i keqdashjes tek subjektet me nyje <5 mm ishte madje i ngjashëm me atë tek subjektet pa nyje 28. Prandaj, madhësia minimale që kërkon monitorim të rregullt CT është 5 mm, siç rekomandohet nga Shoqata Britanike e Torakut (BTS), dhe 6 mm, siç rekomandohet nga Shoqata Fleischner 29. Megjithatë, nyjet më të mëdha se 6 mm dhe pa karakteristika të dukshme beninje, të quajtura nyje pulmonare të papërcaktuara (IPN), mbeten një sfidë e madhe në vlerësimin dhe menaxhimin në praktikën klinike30,31. Më pas ne shqyrtuam nëse madhësia e nyjeve ndikoi në nënshkrimet metabolomike duke përdorur mostra të grumbulluara nga grupet e zbulimit dhe validimit të brendshëm. Duke u përqendruar në 27 biomarkues të validuar, së pari krahasuam profilet PCA të metabolomeve HC dhe BN nën 6 mm. Ne zbuluam se shumica e pikave të të dhënave për HC dhe BN mbivendoseshin, duke demonstruar se nivelet e metabolitëve në serum ishin të ngjashme në të dy grupet (Fig. 3a). Hartat e karakteristikave në diapazonet e ndryshme të madhësive mbetën të ruajtura në BN dhe LA (Fig. 3b, c), ndërsa u vu re një ndarje midis noduleve malinje dhe beninje në diapazonin 6-20 mm (Fig. 3d). Ky grup kishte një AUC prej 0.927, specifikë prej 0.868 dhe ndjeshmëri prej 0.820 për parashikimin e malinjitetit të noduleve që matin 6 deri në 20 mm (Fig. 3e, f). Rezultatet tona tregojnë se klasifikuesi mund të kapë ndryshimet metabolike të shkaktuara nga transformimi i hershëm malinj, pavarësisht nga madhësia e nodulit.
ad Krahasimi i profileve të PCA midis grupeve të specifikuara bazuar në një klasifikues metabolik prej 27 metabolitësh. CC dhe BN < 6 mm. b BN < 6 mm kundrejt BN 6–20 mm. në LA 6–20 mm kundrejt LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm dhe LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Kurba e karakteristikave operative të marrësit (ROC) që tregon performancën e modelit diskriminues për nyjet 6–20 mm. f Vlerat e probabilitetit u llogaritën bazuar në modelin e regresionit logjistik për nyjet që matin 6–20 mm. Vija gri me pika përfaqëson vlerën optimale të ndërprerjes (0.455). Numrat e mësipërm përfaqësojnë përqindjen e rasteve të parashikuara për Los Angeles. Përdorni një test t të Studentit me dy kahe. PCA, analiza e komponentëve kryesorë. Sipërfaqja AUC nën kurbë. Të dhënat burimore ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave burimore.
Katër mostra (të moshës 44-61 vjeç) me madhësi të ngjashme të nodulave pulmonare (7-9 mm) u përzgjodhën më tej për të ilustruar performancën e modelit të propozuar të parashikimit të malinjitetit (Fig. 4a, b). Në shqyrtimin fillestar, Rasti 1 u paraqit si një nodul i ngurtë me kalcifikim, një tipar i shoqëruar me beninjitet, ndërsa Rasti 2 u paraqit si një nodul pjesërisht i ngurtë i papërcaktuar pa tipare të dukshme beninje. Tre raunde skanimesh CT pasuese treguan se këto raste mbetën të qëndrueshme gjatë një periudhe 4-vjeçare dhe për këtë arsye u konsideruan nodula beninje (Fig. 4a). Krahasuar me vlerësimin klinik të skanimeve serike CT, analiza e metabolitëve të serumit me një dozë të vetme me modelin aktual të klasifikuesit identifikoi shpejt dhe saktë këto nodula beninje bazuar në kufizimet probabilistike (Tabela 1). Figura 4b në rastin 3 tregon një nodul me shenja të tërheqjes pleurale, e cila më shpesh shoqërohet me malinjitet32. Rasti 4 u paraqit si një nodul pjesërisht i ngurtë i papërcaktuar pa prova të një shkaku beninj. Të gjitha këto raste u parashikuan si malinje sipas modelit të klasifikuesit (Tabela 1). Vlerësimi i adenokarcinomës së mushkërive u demonstrua nga ekzaminimi histopatologjik pas operacionit të rezeksionit të mushkërive (Fig. 4b). Për grupin e validimit të jashtëm, klasifikuesi metabolik parashikoi me saktësi dy raste të nyjeve të mushkërive të papërcaktuara më të mëdha se 6 mm (Figura Plotësuese 10).
Imazhe CT të dritares aksiale të mushkërive të dy rasteve të nodulave beninje. Në rastin 1, skanimi CT pas 4 vitesh tregoi një nodul të ngurtë të qëndrueshëm me përmasa 7 mm me kalcifikim në lobin e poshtëm të djathtë. Në rastin 2, skanimi CT pas 5 vitesh zbuloi një nodul të qëndrueshëm, pjesërisht të ngurtë me një diametër prej 7 mm në lobin e sipërm të djathtë. b Imazhe CT të dritares aksiale të mushkërive dhe studime patologjike përkatëse të dy rasteve të adenokarcinomës së fazës I para rezeksionit të mushkërive. Rasti 3 zbuloi një nodul me diametër prej 8 mm në lobin e sipërm të djathtë me tërheqje pleurale. Rasti 4 zbuloi një nodul pjesërisht të ngurtë të qelqit të bluar me përmasa 9 mm në lobin e sipërm të majtë. Ngjyrosja me hematoksilinë dhe eozinë (H&E) e indit të mushkërive të rezektuar (shkalla shirit = 50 μm) që demonstron modelin e rritjes acinare të adenokarcinomës së mushkërive. Shigjetat tregojnë nodulat e zbuluara në imazhet CT. Imazhet H&E janë imazhe përfaqësuese të fushave të shumëfishta (>3) mikroskopike të ekzaminuara nga patologu.
Të marra së bashku, rezultatet tona demonstrojnë vlerën potenciale të biomarkuesve të metabolitëve të serumit në diagnozën diferenciale të nodulave pulmonare, të cilat mund të paraqesin sfida gjatë vlerësimit të shqyrtimit me CT.
Bazuar në një panel të validuar të metabolitëve diferencialë, ne kërkuam të identifikonim korrelatet biologjike të ndryshimeve kryesore metabolike. Analiza e pasurimit të shtigjeve KEGG nga MetaboAnalyst identifikoi 6 shtigje të zakonshme me ndryshime të konsiderueshme midis dy grupeve të dhëna (LA kundrejt HC dhe LA kundrejt BN, p i rregulluar ≤ 0.001, efekti > 0.01). Këto ndryshime u karakterizuan nga çrregullime në metabolizmin e piruvatit, metabolizmin e triptofanit, metabolizmin e niacinës dhe nikotinamidit, glikolizën, ciklin TCA dhe metabolizmin e purinës (Fig. 5a). Më pas kryem më tej metabolomikë të synuar për të verifikuar ndryshimet kryesore duke përdorur kuantifikim absolut. Përcaktimi i metabolitëve të zakonshëm në shtigjet e ndryshuara zakonisht me anë të spektrometrisë së masës trefishe kuadrupole (QQQ) duke përdorur standarde autentike të metabolitëve. Karakteristikat demografike të mostrës së synuar të studimit të metabolomikës përfshihen në Tabelën Plotësuese 4. Në përputhje me rezultatet tona globale të metabolomikës, analiza sasiore konfirmoi se hipoksantina dhe ksantina, piruvati dhe laktati ishin rritur në LA krahasuar me BN dhe HC (Fig. 5b, c, p <0.05). Megjithatë, nuk u gjetën dallime të rëndësishme në këto metabolite midis BN dhe HC.
Analiza e pasurimit të rrugës KEGG të metabolitëve dukshëm të ndryshëm në grupin LA krahasuar me grupet BN dhe HC. U përdor një Globaltest me dy bishta dhe vlerat p u rregulluan duke përdorur metodën Holm-Bonferroni (p e rregulluar ≤ 0.001 dhe madhësia e efektit > 0.01). b–d Grafikët e Violinës që tregojnë nivelet e hipoksantinës, ksantinës, laktatit, piruvatit dhe triptofanit në serumin e HC, BN dhe LA të përcaktuara nga LC-MS/MS (n = 70 për grup). Vijat e bardha dhe të zeza me pika tregojnë përkatësisht medianën dhe kuartilin. e Grafiku i Violinës që tregon shprehjen e normalizuar të mRNA-së Log2TPM (transkripte për milion) të SLC7A5 dhe QPRT në adenokarcinomën e mushkërive (n = 513) krahasuar me indin normal të mushkërive (n = 59) në të dhënat LUAD-TCGA. Kutia e bardhë përfaqëson diapazonin ndërkuartil, vija horizontale e zezë në qendër përfaqëson medianën, dhe vija vertikale e zezë që shtrihet nga kutia përfaqëson intervalin e besimit 95% (CI). f Grafiku i korrelacionit Pearson i shprehjes së SLC7A5 dhe GAPDH në adenokarcinomën e mushkërive (n = 513) dhe indin normal të mushkërive (n = 59) në të dhënat e TCGA. Zona gri përfaqëson CI 95%. r, koeficienti i korrelacionit Pearson. g Nivelet qelizore të normalizuara të triptofanit në qelizat A549 të transfektuara me kontroll jo-specifik të shRNA (NC) dhe shSLC7A5 (Sh1, Sh2) të përcaktuara nga LC-MS/MS. Paraqitet analiza statistikore e pesë mostrave biologjikisht të pavarura në secilin grup. h Nivelet qelizore të NADt (NAD total, duke përfshirë NAD+ dhe NADH) në qelizat A549 (NC) dhe qelizat A549 të rrëzuara nga SLC7A5 (Sh1, Sh2). Paraqitet analiza statistikore e tre mostrave biologjikisht të pavarura në secilin grup. Aktiviteti glikolitik i qelizave A549 para dhe pas rrëzimit të SLC7A5 u mat me anë të shkallës së acidifikimit jashtëqelizor (ECAR) (n = 4 mostra biologjikisht të pavarura për grup). 2-DG,2-deoksi-D-glukozë. Testi t i Studentit me dy bishta u përdor në (b–h). Në (g–i), shiritat e gabimit përfaqësojnë mesataren ± SD, çdo eksperiment u krye tre herë në mënyrë të pavarur dhe rezultatet ishin të ngjashme. Të dhënat burimore ofrohen në formën e skedarëve të të dhënave burimore.
Duke marrë parasysh ndikimin e rëndësishëm të metabolizmit të ndryshuar të triptofanit në grupin LA, ne gjithashtu vlerësuam nivelet e triptofanit në serum në grupet HC, BN dhe LA duke përdorur QQQ. Ne zbuluam se triptofani në serum ishte i reduktuar në LA krahasuar me HC ose BN (p < 0.001, Figura 5d), gjë që është në përputhje me gjetjet e mëparshme se nivelet e triptofanit në qarkullim janë më të ulëta tek pacientët me kancer të mushkërive sesa tek kontrollet e shëndetshme nga grupi i kontrollit33,34,35. Një studim tjetër duke përdorur gjurmuesin PET/CT 11C-metil-L-triptofan zbuloi se koha e mbajtjes së sinjalit të triptofanit në indin e kancerit të mushkërive ishte rritur ndjeshëm krahasuar me lezionet beninje ose indin normal36. Ne hipotetizojmë se ulja e triptofanit në serumin LA mund të pasqyrojë thithjen aktive të triptofanit nga qelizat e kancerit të mushkërive.
Dihet gjithashtu se produkti përfundimtar i rrugës së kinureninës së katabolizmit të triptofanit është NAD+37,38, i cili është një substrat i rëndësishëm për reagimin e gliceraldehid-3-fosfatit me 1,3-bisfosfogliceratin në glikolizë39. Ndërsa studimet e mëparshme janë përqendruar në rolin e katabolizmit të triptofanit në rregullimin imunitar, ne kërkuam të sqaronim ndërveprimin midis çrregullimit të triptofanit dhe rrugëve glikolitike të vërejtura në studimin aktual. Familja e transportuesve të tretësirave 7, anëtari 5 (SLC7A5) njihet si një transportues i triptofanit43,44,45. Fosforiboziltransferaza e acidit kinolinik (QPRT) është një enzimë e vendosur poshtë rrugës së kinureninës që konverton acidin kinolinik në NAMN46. Inspektimi i të dhënave LUAD TCGA zbuloi se si SLC7A5 ashtu edhe QPRT ishin rritur ndjeshëm në indet tumorale krahasuar me indet normale (Fig. 5e). Kjo rritje u vu re në fazat I dhe II, si dhe në fazat III dhe IV të adenokarcinomës pulmonare (Figura Plotësuese 11), duke treguar çrregullime të hershme në metabolizmin e triptofanit të shoqëruara me tumorogjenezën.
Për më tepër, të dhënat LUAD-TCGA treguan një korrelacion pozitiv midis shprehjes së ARNi-së SLC7A5 dhe GAPDH në mostrat e pacientëve me kancer (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figura 5f). Në të kundërt, nuk u gjet asnjë korrelacion i rëndësishëm midis nënshkrimeve të tilla të gjeneve në indet normale të mushkërive (r = 0.25, p = 0.06, Figura 5f). Rënia e SLC7A5 (Figura plotësuese 12) në qelizat A549 uli ndjeshëm nivelet qelizore të triptofanit dhe NAD(H) (Figura 5g,h), duke rezultuar në aktivitet të dobësuar glikolitik siç matet nga shkalla e acidifikimit jashtëqelizor (ECAR) (Figura 1). 5i). Kështu, bazuar në ndryshimet metabolike në serum dhe zbulimin in vitro, ne hipotetizojmë se metabolizmi i triptofanit mund të prodhojë NAD+ përmes rrugës së kynureninës dhe të luajë një rol të rëndësishëm në promovimin e glikolizës në kancerin e mushkërive.
Studimet kanë treguar se një numër i madh i nyjeve pulmonare të papërcaktuara të zbuluara nga LDCT mund të çojë në nevojën për testime shtesë si PET-CT, biopsi e mushkërive dhe trajtim i tepërt për shkak të një diagnoze pozitive të rreme të malinjitetit.31 Siç tregohet në Figurën 6, studimi ynë identifikoi një panel metabolitësh serumi me vlerë të mundshme diagnostikuese që mund të përmirësojnë stratifikimin e rrezikut dhe menaxhimin pasues të nyjeve pulmonare të zbuluara nga CT.
Nodulet pulmonare vlerësohen duke përdorur tomografi kompjuterike me dozë të ulët (LDCT) me karakteristika imazherike që sugjerojnë shkaqe beninje ose malinje. Rezultati i pasigurt i noduleve mund të çojë në vizita të shpeshta ndjekëse, ndërhyrje të panevojshme dhe trajtim të tepërt. Përfshirja e klasifikuesve metabolikë të serumit me vlerë diagnostikuese mund të përmirësojë vlerësimin e rrezikut dhe menaxhimin pasues të noduleve pulmonare. Tomografia me emision pozitron PET.
Të dhënat nga studimi NLST i SHBA-së dhe studimi NELSON evropian sugjerojnë që shqyrtimi i grupeve me rrezik të lartë me tomografi kompjuterike me dozë të ulët (LDCT) mund të zvogëlojë vdekshmërinë nga kanceri i mushkërive1,3. Megjithatë, vlerësimi i rrezikut dhe menaxhimi klinik pasues i një numri të madh të nyjeve pulmonare të rastësishme të zbuluara nga LDCT mbeten më sfidueset. Qëllimi kryesor është të optimizohet klasifikimi i saktë i protokolleve ekzistuese të bazuara në LDCT duke përfshirë biomarkues të besueshëm.
Disa biomarkues molekularë, siç janë metabolitët e gjakut, janë identifikuar duke krahasuar kancerin e mushkërive me kontrollet e shëndetshme15,17. Në studimin aktual, ne u përqendruam në zbatimin e analizës së metabolomikës së serumit për të dalluar midis nodulave pulmonare beninje dhe malinje të zbuluara rastësisht nga LDCT. Ne krahasuam metabolomin global të serumit të mostrave të kontrollit të shëndetshëm (HC), nodulave beninje të mushkërive (BN) dhe adenokarcinomës së mushkërive (LA) të fazës I duke përdorur analizën UPLC-HRMS. Ne zbuluam se HC dhe BN kishin profile metabolike të ngjashme, ndërsa LA tregoi ndryshime të rëndësishme krahasuar me HC dhe BN. Ne identifikuam dy grupe metabolitësh të serumit që dallojnë LA nga HC dhe BN.
Skema aktuale e identifikimit të bazuar në LDCT për nyjet beninje dhe malinje bazohet kryesisht në madhësinë, dendësinë, morfologjinë dhe shkallën e rritjes së nyjeve me kalimin e kohës30. Studimet e mëparshme kanë treguar se madhësia e nyjeve është e lidhur ngushtë me gjasat e kancerit të mushkërive. Edhe tek pacientët me risk të lartë, rreziku i malinjitetit në nyjet <6 mm është <1%. Rreziku i malinjitetit për nyjet që matin 6 deri në 20 mm varion nga 8% në 64%30. Prandaj, Shoqata Fleischner rekomandon një diametër kufitar prej 6 mm për ndjekjen rutinë të CT. 29 Megjithatë, vlerësimi i rrezikut dhe menaxhimi i nyjeve pulmonare të papërcaktuara (IPN) më të mëdha se 6 mm nuk janë kryer në mënyrë adekuate 31. Menaxhimi aktual i sëmundjeve kongjenitale të zemrës zakonisht bazohet në pritje vigjilente me monitorim të shpeshtë të CT.
Bazuar në metabolomin e validuar, ne demonstruam për herë të parë mbivendosjen e nënshkrimeve metabolomike midis individëve të shëndetshëm dhe nodulave beninje <6 mm. Ngjashmëria biologjike është në përputhje me gjetjet e mëparshme të CT-së se rreziku i malinjitetit për nodulat <6 mm është po aq i ulët sa për subjektet pa nyje.30 Duhet të theksohet se rezultatet tona gjithashtu tregojnë se nodulat beninje <6 mm dhe ≥6 mm kanë ngjashmëri të lartë në profilet metabolomike, duke sugjeruar që përkufizimi funksional i etiologjisë beninje është i qëndrueshëm pavarësisht nga madhësia e nodulave. Kështu, panelet moderne diagnostikuese të metabolitëve të serumit mund të ofrojnë një analizë të vetme si një test përjashtimi kur nyjet zbulohen fillimisht në CT dhe potencialisht të zvogëlojnë monitorimin serik. Në të njëjtën kohë, i njëjti panel i biomarkuesve metabolikë dalloi nyjet malinje ≥6 mm në madhësi nga nyjet beninje dhe ofroi parashikime të sakta për IPN-të me madhësi të ngjashme dhe karakteristika morfologjike të paqarta në imazhet CT. Ky klasifikues i metabolizmit të serumit performoi mirë në parashikimin e malinjitetit të nodulave ≥6 mm me një AUC prej 0.927. Të marra së bashku, rezultatet tona tregojnë se nënshkrimet unike metabolomike të serumit mund të pasqyrojnë në mënyrë specifike ndryshimet e hershme metabolike të shkaktuara nga tumori dhe kanë vlerë potenciale si parashikues të rrezikut, pavarësisht nga madhësia e nyjeve.
Veçanërisht, adenokarcinoma e mushkërive (LUAD) dhe karcinoma me qeliza skuamoze (LUSC) janë llojet kryesore të kancerit të mushkërive me qeliza jo të vogla (NSCLC). Duke pasur parasysh se LUSC është i lidhur fort me përdorimin e duhanit47 dhe LUAD është histologjia më e zakonshme e nyjeve të mushkërive të rastësishme të zbuluara në shqyrtimin CT48, modeli ynë i klasifikuesit u ndërtua posaçërisht për mostrat e adenokarcinomës së fazës I. Wang dhe kolegët e tij u përqendruan gjithashtu në LUAD dhe identifikuan nëntë nënshkrime lipidike duke përdorur lipidomikë për të dalluar kancerin e mushkërive në fazën e hershme nga individë të shëndetshëm17. Ne testuam modelin aktual të klasifikuesit në 16 raste të LUSC në fazën I dhe 74 nyje beninje dhe vumë re saktësi të ulët parashikimi të LUSC (AUC 0.776), duke sugjeruar që LUAD dhe LUSC mund të kenë nënshkrimet e tyre metabolomike. Në të vërtetë, LUAD dhe LUSC janë treguar se ndryshojnë në etiologji, origjinë biologjike dhe aberacione gjenetike49. Prandaj, lloje të tjera të histologjisë duhet të përfshihen në modelet e trajnimit për zbulimin e bazuar në popullatë të kancerit të mushkërive në programet e shqyrtimit.
Këtu, ne identifikuam gjashtë rrugët e ndryshuara më shpesh në adenokarcinomën e mushkërive krahasuar me kontrollet e shëndetshme dhe nyjet beninje. Ksantina dhe hipoksantina janë metabolitë të zakonshëm të rrugës metabolike të purinës. Në përputhje me rezultatet tona, ndërmjetësit e shoqëruar me metabolizmin e purinës u rritën ndjeshëm në serumin ose indet e pacientëve me adenokarcinomë të mushkërive krahasuar me kontrollet e shëndetshme ose pacientët në fazën para-invazive15,50. Nivelet e larta të ksantinës dhe hipoksantinës në serum mund të pasqyrojnë anabolizmin e kërkuar nga qelizat kancerogjene që shumohen me shpejtësi. Çrregullimi i metabolizmit të glukozës është një shenjë dalluese e njohur e metabolizmit të kancerit51. Këtu, ne vumë re një rritje të konsiderueshme të piruvatit dhe laktatit në grupin LA krahasuar me grupin HC dhe BN, gjë që është në përputhje me raportet e mëparshme të anomalive të rrugës glikolitike në profilet e metabolomës së serumit të pacientëve me kancer të mushkërive jo-qelizor të qelizave të vogla (NSCLC) dhe kontrolleve të shëndetshme. Rezultatet janë konsistente52,53.
Është e rëndësishme të theksohet se ne vumë re një korrelacion të anasjelltë midis metabolizmit të piruvatit dhe triptofanit në serumin e adenokarcinomës së mushkërive. Nivelet e triptofanit në serum u ulën në grupin LA krahasuar me grupin HC ose BN. Është interesante se një studim i mëparshëm në shkallë të gjerë duke përdorur një grup prospektiv zbuloi se nivelet e ulëta të triptofanit në qarkullim shoqëroheshin me një rrezik në rritje të kancerit të mushkërive 54. Triptofani është një aminoacid esencial që e marrim tërësisht nga ushqimi. Ne konkludojmë se pakësimi i triptofanit në serum në adenokarcinomën e mushkërive mund të pasqyrojë pakësimin e shpejtë të këtij metaboliti. Dihet mirë se produkti përfundimtar i katabolizmit të triptofanit nëpërmjet rrugës së kynureninës është burimi i sintezës de novo të NAD+. Meqenëse NAD+ prodhohet kryesisht nëpërmjet rrugës së shpëtimit, rëndësia e NAD+ në metabolizmin e triptofanit në shëndet dhe sëmundje mbetet për t'u përcaktuar46. Analiza jonë e bazës së të dhënave TCGA tregoi se shprehja e transportuesit të tretësirës së transportuesit të triptofanit 7A5 (SLC7A5) ishte rritur ndjeshëm në adenokarcinomën e mushkërive krahasuar me kontrollet normale dhe ishte e korreluar pozitivisht me shprehjen e enzimës glikolitike GAPDH. Studimet e mëparshme janë përqendruar kryesisht në rolin e katabolizmit të triptofanit në shtypjen e përgjigjes imune antitumorale40,41,42. Këtu ne demonstrojmë se frenimi i thithjes së triptofanit duke ulur nivelin e SLC7A5 në qelizat e kancerit të mushkërive rezulton në një rënie të mëvonshme të niveleve qelizore të NAD dhe një dobësim të njëkohshëm të aktivitetit glikolitik. Si përmbledhje, studimi ynë ofron një bazë biologjike për ndryshimet në metabolizmin e serumit të shoqëruara me transformimin malinj të adenokarcinomës së mushkërive.
Mutacionet e EGFR janë mutacionet nxitëse më të zakonshme tek pacientët me NSCLC. Në studimin tonë, zbuluam se pacientët me mutacion të EGFR (n = 41) kishin profile të përgjithshme metabolomike të ngjashme me pacientët me EGFR të tipit të egër (n = 31), megjithëse gjetëm nivele të ulëta në serum të disa pacientëve me mutant të EGFR tek pacientët me acilkarnitinë. Funksioni i vendosur i acilkarnitinave është transportimi i grupeve acil nga citoplazma në matricën mitokondriale, duke çuar në oksidimin e acideve yndyrore për të prodhuar energji 55. Në përputhje me gjetjet tona, një studim i kohëve të fundit identifikoi gjithashtu profile të ngjashme metabolomesh midis tumoreve mutante të EGFR dhe tumoreve të tipit të egër të EGFR duke analizuar metabolomin global të 102 mostrave të indeve të adenokarcinomës së mushkërive 50. Është interesante se përmbajtja e acilkarnitinës u gjet edhe në grupin me mutant të EGFR. Prandaj, nëse ndryshimet në nivelet e acilkarnitinës pasqyrojnë ndryshimet metabolike të shkaktuara nga EGFR dhe rrugët molekulare themelore mund të meritojnë studime të mëtejshme.
Si përfundim, studimi ynë krijon një klasifikues metabolik serik për diagnozën diferenciale të nodulave pulmonare dhe propozon një rrjedhë pune që mund të optimizojë vlerësimin e rrezikut dhe të lehtësojë menaxhimin klinik bazuar në shqyrtimin me skanim CT.
Ky studim u miratua nga Komiteti i Etikës i Spitalit Universitar të Kancerit Sun Yat-sen, Spitalit të Parë të Filialit të Universitetit Sun Yat-sen dhe Komitetit të Etikës së Spitalit Universitar të Kancerit Zhengzhou. Në grupet e zbulimit dhe të validimit të brendshëm, u mblodhën 174 serume nga individë të shëndetshëm dhe 244 serume nga nodule beninje nga individë që i nënshtroheshin ekzaminimeve mjekësore vjetore në Departamentin e Kontrollit dhe Parandalimit të Kancerit, Qendrën e Kancerit Universitar Sun Yat-sen, dhe 166 nodule beninje në serum. Adenokarcinomat e mushkërive të fazës I u mblodhën nga Qendra e Kancerit Universitar Sun Yat-sen. Në kohortën e validimit të jashtëm, kishte 48 raste të noduleve beninje, 39 raste të adenokarcinomës së mushkërive të fazës I nga Spitali i Parë i Filialit të Universitetit Sun Yat-sen dhe 24 raste të adenokarcinomës së mushkërive të fazës I nga Spitali i Kancerit Zhengzhou. Qendra e Kancerit Universitar Sun Yat-sen gjithashtu mblodhi 16 raste të kancerit të mushkërive me qeliza skuamoze të fazës I për të testuar aftësinë diagnostikuese të klasifikuesit metabolik të vendosur (karakteristikat e pacientit tregohen në Tabelën Plotësuese 5). Mostrat nga grupi i zbulimit dhe grupi i validimit të brendshëm u mblodhën midis janarit 2018 dhe majit 2020. Mostrat për grupin e validimit të jashtëm u mblodhën midis gushtit 2021 dhe tetorit 2022. Për të minimizuar paragjykimet gjinore, secilit grup iu caktuan afërsisht një numër i barabartë rastesh meshkuj dhe femra. Ekipi i Zbulimit dhe Ekipi i Rishikimit të Brendshëm. Gjinia e pjesëmarrësit u përcaktua bazuar në vetë-raportimin. U mor pëlqimi i informuar nga të gjithë pjesëmarrësit dhe nuk u ofrua asnjë kompensim. Subjektet me nyje beninje ishin ata me një rezultat të qëndrueshëm të skanimit CT në 2 deri në 5 vjet në kohën e analizës, përveç 1 rasti nga mostra e validimit të jashtëm, e cila u mblodh para operacionit dhe u diagnostikua me histopatologji. Me përjashtim të bronkitit kronik. Rastet e adenokarcinomës së mushkërive u mblodhën para rezeksionit të mushkërive dhe u konfirmuan me diagnozë patologjike. Mostrat e gjakut esëll u mblodhën në tuba ndarës të serumit pa asnjë antikoagulant. Mostrat e gjakut u mpiksën për 1 orë në temperaturën e dhomës dhe më pas u centrifuguan në 2851 × g për 10 minuta në 4°C për të mbledhur supernatantin e serumit. Alikuotat e serumit u ngrinë në -80°C deri në nxjerrjen e metabolitëve. Departamenti i Parandalimit të Kancerit dhe Ekzaminimit Mjekësor i Qendrës së Kancerit të Universitetit Sun Yat-sen mblodhi një grup serumi nga 100 donatorë të shëndetshëm, duke përfshirë një numër të barabartë burrash dhe grash të moshës 40 deri në 55 vjeç. Vëllime të barabarta të secilës mostër donatori u përzien, grupi që rezultoi u alikuotua dhe u ruajt në -80°C. Përzierja e serumit u përdor si material referimi për kontrollin e cilësisë dhe standardizimin e të dhënave.
Serumi referues dhe mostrat e testimit u shkrinë dhe metabolitët u nxorën duke përdorur një metodë të kombinuar nxjerrjeje (MTBE/metanol/ujë) 56. Shkurtimisht, 50 μl serum u përzie me 225 μl metanol të ftohtë me akull dhe 750 μl metil tert-butil eter (MTBE) të ftohtë me akull. Përzieni përzierjen dhe inkubojeni në akull për 1 orë. Mostrat më pas u përzien dhe u përzien në vorteks me 188 μl ujë të gradës MS që përmbante standarde të brendshme (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metioninë dhe 13C6-izoleucinë, të blera nga Cambridge Isotope Laboratories). Përzierja më pas u centrifugua në 15,000 × g për 10 minuta në 4 °C, dhe faza e poshtme u transferua në dy tuba (125 μL secila) për analizën LC-MS në modalitete pozitive dhe negative. Së fundmi, mostra u avullua deri në tharje në një koncentrator vakumi me shpejtësi të lartë.
Metabolitët e tharë u rikonstituuan në 120 μl acetonitril 80%, u përzien në vorteks për 5 minuta dhe u centrifuguan në 15,000 × g për 10 minuta në 4°C. Supernatantët u transferuan në shishe qelqi ngjyrë qelibar me mikroinserte për studime metabolomike. Analiza e metabolomikës së pashënjestruar në një platformë kromatografie të lëngshme me performancë ultra-performuese-spektrometri masive me rezolucion të lartë (UPLC-HRMS). Metabolitët u ndanë duke përdorur një sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC dhe një kolonë ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). Në modalitetin e joneve pozitive, fazat mobile ishin 95% (A) dhe 50% acetonitril (B), secila që përmbante 10 mmol/L acetat amoniumi dhe 0.1% acid formik. Në modalitetin negativ, fazat mobile A dhe B përmbanin përkatësisht 95% dhe 50% acetonitril, të dyja fazat përmbanin 10 mmol/L acetat amoniumi, pH = 9. Programi i gradientit ishte si më poshtë: 0–0.5 min, 2% B; 0.5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16.1 min, 98–2% B; 16.1–20 min, 2% B. Kolona u mbajt në 40°C dhe mostra në 10°C në automompler. Shpejtësia e rrjedhjes ishte 0.3 ml/min, vëllimi i injektimit ishte 3 μl. Një spektrometër masiv Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) me një burim jonizimi me elektrospërkatje (ESI) u operua në modalitetin e skanimit të plotë dhe u shoqërua me modalitetin e monitorimit ddMS2 për të mbledhur vëllime të mëdha të dhënash. Parametrat MS u vendosën si më poshtë: tensioni i spërkatjes +3.8 kV/- 3.2 kV, temperatura kapilare 320°C, gaz mbrojtës 40 arb, gaz ndihmës 10 arb, temperatura e ngrohësit të sondës 350°C, diapazoni i skanimit 70–1050 m/h, rezolucioni 70 000. Të dhënat u morën duke përdorur Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Për të vlerësuar cilësinë e të dhënave, u gjeneruan mostra të kontrollit të cilësisë (QC) të grupuara duke hequr 10 μL alikuota të supernatantit nga secila mostër. Gjashtë injeksione të mostrave të kontrollit të cilësisë u analizuan në fillim të sekuencës analitike për të vlerësuar stabilitetin e sistemit UPLC-MS. Mostrat e kontrollit të cilësisë më pas futen periodikisht në seri. Të 11 seritë e mostrave të serumit në këtë studim u analizuan nga LC-MS. Alikuotat e një përzierjeje serumi nga 100 donatorë të shëndetshëm u përdorën si material referimi në seritë përkatëse për të monitoruar procesin e nxjerrjes dhe për të përshtatur efektet seri-me-seri. Analiza e metabolomikës së pashënjestruar e grupit të zbulimit, grupit të validimit të brendshëm dhe grupit të validimit të jashtëm u krye në Qendrën e Metabolomikës të Universitetit Sun Yat-sen. Laboratori i jashtëm i Qendrës së Analizës dhe Testimit të Universitetit të Teknologjisë Guangdong analizoi gjithashtu 40 mostra nga grupi i jashtëm për të testuar performancën e modelit të klasifikuesit.
Pas nxjerrjes dhe rikonstituimit, përcaktimi absolut i metabolitëve të serumit u mat duke përdorur kromatografi të lëngshme me performancë ultra të lartë - spektrometri masive tandem (Agilent 6495 triple quadrupole) me një burim jonizimi me elektrospray (ESI) në modalitetin e monitorimit të reaksioneve të shumëfishta (MRM). Një kolonë ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) u përdor për të ndarë metabolitët. Faza mobile përbëhej nga 90% (A) dhe 5% acetonitril (B) me 10 mmol/L acetat amoniumi dhe 0.1% tretësirë amoniaku. Programi i gradientit ishte si më poshtë: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0% B. Kolona u mbajt në 40 °C dhe mostra në 10 °C në automostrues. Shkalla e rrjedhjes ishte 0.3 mL/min dhe vëllimi i injektimit ishte 1 μL. Parametrat MS u vendosën si më poshtë: tensioni kapilar ±3.5 kV, presioni i nebulizatorit 35 psi, rrjedha e gazit të mbështjellësit 12 L/min, temperatura e gazit të mbështjellësit 350°C, temperatura e gazit të tharjes 250°C dhe rrjedha e gazit të tharjes 14 l/min. Konvertimet MRM të triptofanit, piruvatit, laktatit, hipoksantinës dhe ksantinës ishin përkatësisht 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 dhe 151.0–107.9. Të dhënat u mblodhën duke përdorur Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Për mostrat e serumit, triptofani, piruvati, laktati, hipoksantina dhe ksantina u përcaktuan duke përdorur kurbat e kalibrimit të tretësirave standarde të përzierjes. Për mostrat qelizore, përmbajtja e triptofanit u normalizua në standardin e brendshëm dhe masën e proteinave qelizore.
Ekstraktimi i kulmit (m/z dhe koha e mbajtjes (RT)) u krye duke përdorur Compound Discovery 3.1 dhe TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Për të eliminuar ndryshimet e mundshme midis serive, çdo kulm karakteristik i mostrës së testimit u nda me kulmin karakteristik të materialit referues nga i njëjti grup për të marrë bollëkun relativ. Devijimet standarde relative të standardeve të brendshme para dhe pas standardizimit tregohen në Tabelën Plotësuese 6. Dallimet midis dy grupeve u karakterizuan nga shkalla e zbulimit të rremë (FDR <0.05, testi i renditjes së shënuar Wilcoxon) dhe ndryshimi i palosur (>1.2 ose <0.83). Të dhënat e papërpunuara MS të karakteristikave të nxjerra dhe të dhënat MS të korrigjuara nga serumi referues tregohen përkatësisht në të Dhënat Plotësuese 1 dhe të Dhënat Plotësuese 2. Shënimi i kulmit u krye bazuar në katër nivele të përcaktuara të identifikimit, duke përfshirë metabolitët e identifikuar, përbërjet e supozuara të shënuara, klasat e përbërjeve të supozuara të karakterizuara dhe përbërjet e panjohura 22. Bazuar në kërkimet në bazën e të dhënave në Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), përbërjet biologjike me standarde të validuara që përputhen me MS/MS ose shënime të përputhjes së saktë në mzCloud (rezultati > 85) ose Chemspider u përzgjodhën përfundimisht si ndërmjetës midis metabolomit diferencial. Shënimet e kulmit për secilën veçori përfshihen në të Dhënat Plotësuese 3. MetaboAnalyst 5.0 u përdor për analizën univariate të bollëkut të metabolitëve të normalizuar me shumë. MetaboAnalyst 5.0 gjithashtu vlerësoi analizën e pasurimit të rrugës KEGG bazuar në metabolitë dukshëm të ndryshëm. Analiza e komponentëve kryesorë (PCA) dhe analiza diskriminuese e pjesshme e katrorëve më të vegjël (PLS-DA) u analizuan duke përdorur paketën softuerike ropls (v.1.26.4) me normalizim të grumbullit dhe autoshkallëzim. Modeli optimal i bioshënuesit të metabolitëve për parashikimin e malinjitetit të nyjeve u gjenerua duke përdorur regresionin logjistik binar me operatorin më të vogël të tkurrjes absolute dhe përzgjedhjes (LASSO, paketa R v.4.1-3). Performanca e modelit dallues në setet e zbulimit dhe validimit u karakterizua duke vlerësuar AUC bazuar në analizën ROC sipas paketës pROC (v.1.18.0.). Kufiri optimal i probabilitetit u mor bazuar në indeksin maksimal Youden të modelit (ndjeshmëri + specifikë - 1). Mostrat me vlera më të vogla ose më të mëdha se pragu do të parashikohen si nyje beninje dhe adenokarcinoma të mushkërive, përkatësisht.
Qelizat A549 (#CCL-185, Koleksioni Amerikan i Kulturave të Tipit) u rritën në një mjedis F-12K që përmbante 10% FBS. Sekuencat e ARN-së së shkurtër në formë fijesh (shRNA) që synonin SLC7A5 dhe një kontroll jo-shënjestrues (NC) u futën në vektorin lentiviral pLKO.1-puro. Sekuencat antisens të shSLC7A5 janë si më poshtë: Sh1 (5′-GGAGAAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antitrupat ndaj SLC7A5 (#5347) dhe tubulinës (#2148) u blenë nga Cell Signaling Technology. Antitrupat ndaj SLC7A5 dhe tubulinës u përdorën në një hollim 1:1000 për analizën Western blot.
Testi i Stresit Glikolitik Seahorse XF mat nivelet e acidifikimit jashtëqelizor (ECAR). Në analizë, glukoza, oligomicina A dhe 2-DG u administruan në mënyrë të njëpasnjëshme për të testuar kapacitetin glikolitik qelizor të matur nga ECAR.
Qelizat A549 të transfektuara me kontroll jo-targetues (NC) dhe shSLC7A5 (Sh1, Sh2) u vendosën gjatë natës në enë me diametër 10 cm. Metabolitët e qelizave u nxorën me 1 ml metanol ujor 80% të ftohtë me akull. Qelizat në tretësirën e metanolit u gërryen, u mblodhën në një tub të ri dhe u centrifuguan në 15,000 × g për 15 minuta në 4°C. Mblidhni 800 µl supernatant dhe thajini duke përdorur një koncentrator vakumi me shpejtësi të lartë. Peletet e metabolitëve të tharë u analizuan më pas për nivelet e triptofanit duke përdorur LC-MS/MS siç përshkruhet më sipër. Nivelet qelizore të NAD(H) në qelizat A549 (NC dhe shSLC7A5) u matën duke përdorur një komplet kolorimetrik sasior NAD+/NADH (#K337, BioVision) sipas udhëzimeve të prodhuesit. Nivelet e proteinave u matën për secilën mostër për të normalizuar sasinë e metabolitëve.
Nuk u përdorën metoda statistikore për të përcaktuar paraprakisht madhësinë e mostrës. Studimet e mëparshme të metabolomikës që synonin zbulimin e bioshënuesve15,18 janë konsideruar si pika referimi për përcaktimin e madhësisë, dhe krahasuar me këto raporte, mostra jonë ishte e përshtatshme. Asnjë mostër nuk u përjashtua nga grupi i studimit. Mostrat e serumit u caktuan rastësisht në një grup zbulimi (306 raste, 74.6%) dhe një grup validimi të brendshëm (104 raste, 25.4%) për studime të metabolomikës të pashënjestruara. Ne gjithashtu zgjodhëm rastësisht 70 raste nga secili grup nga grupi i zbulimeve për studimet e metabolomikës të synuara. Studiuesit ishin të verbër ndaj caktimit të grupit gjatë mbledhjes dhe analizës së të dhënave LC-MS. Analizat statistikore të të dhënave të metabolomikës dhe eksperimenteve qelizore përshkruhen në seksionet përkatëse të Rezultateve, Legjendave të Figurave dhe Metodave. Përcaktimi sasior i triptofanit qelizor, NADT dhe aktivitetit glikolitik u krye tre herë në mënyrë të pavarur me rezultate identike.
Për më shumë informacion rreth dizajnit të studimit, shihni Abstraktin e Raportit të Portofolit Natyror që lidhet me këtë artikull.
Të dhënat e papërpunuara MS të karakteristikave të nxjerra dhe të dhënat e normalizuara MS të serumit referues tregohen përkatësisht në të Dhënat Plotësuese 1 dhe të Dhënat Plotësuese 2. Shënimet e kulmeve për karakteristikat diferenciale paraqiten në të Dhënat Plotësuese 3. Seti i të dhënave LUAD TCGA mund të shkarkohet nga https://portal.gdc.cancer.gov/. Të dhënat hyrëse për ndërtimin e grafikut janë dhënë në të dhënat burimore. Të dhënat burimore janë dhënë për këtë artikull.
Grupi Kombëtar i Studimit për Shqyrtimin e Mushkërive, etj. Ulja e vdekshmërisë nga kanceri i mushkërive me tomografi kompjuterike me dozë të ulët. Anglia Veriore. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR dhe Prophet, PC Skrinimi i kancerit të mushkërive duke përdorur skanim helikal me dozë të ulët: rezultatet nga Studimi Kombëtar i Skrinimit të Mushkërive (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Ulja e vdekshmërisë nga kanceri i mushkërive me anë të skriningut volumetrik CT në një provë të rastësishme. Anglia Veriore. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Koha e postimit: 18 shtator 2023